Los genes y los microARN tienen múltiples sitios de unión.

El portador inhibidor de la esponja de mirna construido a partir de genes simbióticos ha sido especialmente optimizado para mejorar la capacidad de adsorción al tiempo que agrega más sitios de unión, mejorando así la capacidad inhibidora de los miARN o siARN maduros y debilitando los miARN o siARN intracelulares inducidos. Efecto de silenciamiento génico para estudiar la pérdida de función de miRNA o siRNA.

Recientemente se diseñó un proyecto para verificar si el microARN se une al gen diana previsto. Al mismo tiempo, si el SNP en la región 3'-UTR del gen diana afecta su relación. Este sitio SNP está ubicado en la región de la semilla y se especula que también tiene una función determinada. El primer paso es clonar microARN en un vector de expresión y clonar la región 3'-UTR aguas abajo del gen de luciferasa de control PGL-3 (incluido el tipo salvaje y el mutante). Después de la doble transformación, utilice el sistema indicador de luciferasa para detectar si los dos genes se unen y si el sitio SNP afecta la unión.

Por favor, dígame el diseño experimental específico:

1. Qué línea celular elegir para el experimento y qué línea celular tiene una expresión endógena alta o baja del gen objetivo y del miARN. ¿El genotipo de la línea celular afecta los resultados experimentales?

2. ¿Es apropiado el vector que elegí? Si el vector de expresión lentiviral (producto comercial) se puede utilizar para miARN, ¿se puede utilizar directamente o es necesario rehacerlo? ¿Cómo es la sala de control 3 de PGL? ¿Existe un sitio adecuado para la clonación? Solo se encuentra XbaI. PGL-TK se utiliza como control interno porque no estoy familiarizado con este conjunto de vectores y no sé si es apropiado elegirlo.

3. Si la verificación es exitosa, ¿qué evidencia experimental se necesita y cómo se llevará a cabo la investigación funcional posterior? ¿Todavía necesitamos usar ARNi para inhibir la expresión del gen objetivo y luego transferir los genes mutantes y de tipo salvaje para ver el efecto?

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