Células de mamífero
Si la integridad del ARN es baja, ¿los resultados necesariamente serán malos? Es hora de revelar la verdad. Mi hermano menor publicó una reseña del profesor en Nature Plants, y todavía estoy contando los 5 principales modelos de ratón en la investigación de la inmunidad tumoral durante mi extensión de doctorado, lo que le ahorrará medio mes de búsqueda. Literatura. Científicos chinos explican cómo hacer que las proteínas sean más puras.
Aunque el sistema de expresión de E.coli es económico y asequible, su uso para expresar proteínas eucariotas puede verse afectado por la falta de lípidos moleculares importantes. quelatos e importantes modificaciones postraduccionales. El plegamiento y la función de la proteína en sí, tomando como ejemplo las proteínas de membrana, el sistema de expresión de E. coli puede afectar la posición de inserción de la proteína diana en la membrana celular y su función prevista [1]. ]. Además, cuando la proteína diana tiene más de 50 kDa, se puede expresar proteína incompleta utilizando el sistema de E. coli [2].
La historia de Strep-tag? ya se mencionó anteriormente (haga clic aquí para revisarla). Ahora nos centraremos en la aplicación de Strep-tag?
Aunque el sistema de expresión de E.coli es económico y asequible, debido a la falta de lípidos importantes, quelatos moleculares y modificaciones postraduccionales importantes, su uso para expresar proteínas eucariotas puede afectar a la propia proteína. plegamiento y función de la proteína diana, tomando como ejemplo las proteínas de membrana, el sistema de expresión de E. coli puede afectar la posición de inserción de la proteína diana en la membrana celular y su función prevista [1]. Además, cuando la proteína diana tiene más de 50 kDa, se puede expresar proteína incompleta utilizando el sistema de E. coli [2].
Por lo tanto, para estudiar la función de proteínas específicas (como las vías de señalización), producir proteínas de mayor tamaño o realizar análisis estructurales de alta resolución, cada vez más grupos experimentales optan por sistemas de expresión de mamíferos de producción. proteínas. La razón es que las proteínas recombinantes producidas por células de mamíferos son muy similares a las proteínas humanas y tienen un plegamiento, ensamblaje y modificaciones postraduccionales de proteínas relativamente completos [3]. Por lo tanto, cada vez más científicos prestan más atención a cómo purificar eficientemente las proteínas diana de las células de mamíferos.
Selección de etiquetas de afinidad
En primer lugar, debe considerar elegir una etiqueta de afinidad adecuada. Las etiquetas de afinidad comúnmente utilizadas en los sistemas de expresión de mamíferos incluyen His-tag, FLAG-tag, GST-tag y Strep-tag?, que se resumen en la siguiente tabla:
Estas etiquetas de afinidad cada una tiene sus propios méritos en uso.
Cuando se utiliza His-tag, un problema común es la unión no específica de las proteínas del huésped al relleno. Esta situación es aún más evidente durante la purificación de proteínas recombinantes de mamíferos. Dado que hay muchas proteínas que contienen residuos de histidina en el sistema, esta estructura proteica es similar a su etiqueta y es fácil de unir a la columna de níquel, lo que conduce a una reducción en la pureza de la proteína objetivo [13].
El sistema FLAG-tag se puede purificar en condiciones no desnaturalizantes y puede obtener proteínas activas de alta pureza. Sin embargo, su desventaja es que el medio de purificación es relativamente inestable y el costo de purificación es mucho mayor [. 5].
Otra etiqueta comúnmente utilizada es la GST-tag, una proteína de 26 kDa, que se caracteriza por una alta expresión y una alta antigenicidad. A menudo se usa para aumentar la solubilidad de la proteína objetivo, pero a menudo afecta las características de la misma. proteína objetivo, generalmente se recomienda eliminar la etiqueta después de la purificación [8].
Strep-tag? (incluyendo Strep-tag?II o Twin-Strep-tag?) son etiquetas peptídicas cortas, con 8 o 28 aminoácidos respectivamente, y generalmente no interfieren con el plegamiento o la actividad de las proteínas. , por lo que es adecuado para estudios funcionales de proteínas [5]. Strep-tag? se une específicamente al sitio de unión de biotina de Strep-Tactin? (medio de segunda generación) o Strep-Tactin? La destiobiotina (aplicable a la segunda generación) o la biotina (tercera generación) utilizadas durante la elución tienen una mayor afinidad por el mismo sitio de unión y pueden eliminar la proteína objetivo de la misma posición, por lo que la pureza de la proteína objetivo obtenida es superior a la media. 95%[12].
Al mismo tiempo, ¿la afinidad de la Strep-Tactin de tercera generación? Originalmente, cuando se usa la segunda generación, la biotina en el medio de cultivo debe bloquearse primero con Avidin o BioLock, para no dañarla. afectar el rendimiento de la purificación).
¿La afinidad del Strep-Tactin de tercera generación?
Figura A: Agregue 4 mg de mCherry-Twin-Strep-tag (TST) al sobrenadante de cultivo de células ExpiCHO de proteína fluorescente Strep-Tactin?) o mCherry-His-tag (His) (Nota: El Los siguientes experimentos se basan todos en el sobrenadante de células de mamíferos que expresan un determinado anticuerpo y se agrega proteína objetivo de alta pureza para los experimentos). Como puede verse en la figura, ¿Strep-Tactin?
Además, también probamos otras proteínas, como SEAP (72 kDa) o anticuerpos (mAb, que se reforzó a 55 kDa). La Figura B muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de SEAP-TST, mCherry-TST y mAb-TST purificados por Strep-Tactin? (Nota: la marca roja es el producto de degradación de mCherry, no una banda híbrida)
Figura B
Debido a la alta afinidad de Strep-Tactin ¿La concentración de la proteína objetivo? es bajo y Strep-Tactin?XT aún puede capturar eficazmente la proteína objetivo en el sobrenadante. La Tabla C resume los datos de varios experimentos y muestra que cuando la concentración de proteína objetivo es inferior a 20 μl/ml, el rendimiento aún puede alcanzar casi el 100%.
Tabla C
Strep-Tactin? La línea celular de mamíferos comúnmente utilizada para la producción de proteínas es HEK293 (células de riñón embrionario humano), que es más sencilla de usar que el CHO. Probamos el rendimiento de purificación de Strep-Tactin?XT: la Tabla D1 muestra la concentración de la proteína objetivo después de expresar la proteína SEAP-TST o mCherry-TST con Expi293. La Figura D2 muestra el análisis SDS-PAGE del rendimiento de la purificación. Se puede ver a partir de esto que, al igual que el medio de cultivo ExpiCHO, la adición directa del sobrenadante de Expi293 expresado a una columna de gravedad de alta carga Strep-Tactin?XT de 1 ml para la purificación puede obtener rápidamente proteínas objetivo de alta pureza.
Tabla D1
Figura D2
En resumen, Strep-tag?es muy adecuado para expresar proteínas diana en líneas celulares de mamíferos, y su proceso de purificación es muy adecuado. también es compatible con los medios comunes ExpiCHO y Expi293 y no requiere procesamiento adicional, lo que hace que el proceso experimental sea más conveniente. Junto con las ventajas de pureza del sistema Strep-tag, actualmente es una excelente opción para esta aplicación.
Referencias
1. Sahdev S, Khattar SK, Saini KS (2008). Producción de proteínas eucariotas activas a través de sistemas de expresión bacteriana: una revisión de las estrategias biotecnológicas existentes Mol Cell Biochem. ., 307(1-2):249-64
2. Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, Mccafferty J (2004) Producción de proteínas solubles de mamíferos en Escherichia coli: identificación de. características de proteínas que se correlacionan con una expresión exitosa.
4. Wegner GJ, Lee HJ, Corn RM (2002). el estudio de las interacciones epítopo-anticuerpo utilizando pla *** de superficie en imágenes de resonancia Anal Chem., 74(20):5161-8
5. Terpe K (2003). : de los fundamentos moleculares y bioquímicos a los sistemas comerciales. Appl.Microbiol.Biotechnol.,60(5): 523-33 doi: 10.1007/s00253-002-1158-6
6. Lichty JJ, Malecki. JL, Agnew HD, Michelson-Horowitz DJ, Tan S (2005). Comparación de etiquetas de afinidad para la purificación de proteínas Protein Expr Purif., 41(1):98-105. Simons PC, Cimino DF, Sanchez L, Waller A, Posner RG, Wandinger-Ness A, Prossnitz ER, Sklar LA (2006) La proteína de fusión glutatión-S-transferasa-proteína fluorescente verde revela una disociación lenta de cuentas y medidas de alta densidad de sitio. GSH libre.
ry A., 69(5):326-34.
8. Kimple ME, Brill AL, Pasker RL (2013). Unidad 9.9 doi: 10.1002/0471140864.ps0909s73.
9. GE Healthcare (2016). Manual de cromatografía de afinidad, vol. 2: Proteínas etiquetadas. 2015). Manual de expresión de proteínas
11. Biosensores dinámicos (2018) Nota de aplicación: Captura de alta afinidad de proteínas marcadas en el biochip switchSENSE? utilizando Strep-Tactin?XT
12. IBA Lifesciences (2016) Nota de aplicación: Strep-Tactin?XT:Twin-Strep-tag?- Ventajas del sistema de purificación His-tag
13. Bornhorst JA, Falke JJ (2000). Purificación de proteínas utilizando etiquetas de afinidad de polihistidina. Methods Enzymol., 326:245-54
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Fuente del artículo: iba Tema: Strep-Tactin?XT, etiqueta de afinidad