¿Cuáles son los métodos para el cultivo a gran escala de células animales?
Métodos comunes para el cultivo a gran escala de células animales
Según el tipo de células animales, se pueden utilizar tres métodos de cultivo, incluido el cultivo adherente, el cultivo en suspensión y el cultivo inmovilizado. cultura a gran escala.
1. Características del crecimiento de las células animales y temperatura del cultivo
1. Las células crecen lentamente y se contaminan fácilmente, y se requieren antibióticos para el cultivo.
2. grandes y sin pared celular, baja resistencia mecánica, escasa adaptabilidad ambiental
3 Baja demanda de oxígeno, intolerante a la ventilación fuerte y a la agitación
Efecto de crecimiento grupal, crecimiento adherente (anclaje) dependencia)
5. Los productos del proceso de cultivo se distribuyen dentro y fuera de las células, y el costo es alto
6. Las células cultivadas primarias generalmente se reproducen durante 50 generaciones antes de degenerar y moribundos
Según el cultivo in vitro, las células animales se pueden dividir en dos categorías debido a las diferencias en la dependencia del sustrato de crecimiento:
Células dependientes de anclaje: deben estar unidas a un sólido o Superficie semisólida con una cantidad adecuada de carga para crecer. La mayoría de las células animales, incluidas las células no linfoides, los histiocitos y muchas células aneuploides entran en esta categoría.
Células independientes de anclaje: células que no necesitan estar adheridas a una superficie sólida para crecer, incluidas la sangre, las células del tejido linfoide, muchas células tumorales y algunas células transformadas.
La temperatura óptima para el cultivo de células es equivalente a la temperatura normal del cuerpo del que se extraen diversas células o tejidos. La temperatura óptima para el cultivo de células humanas y de mamíferos es de 35 a 37 °C. Si la temperatura se desvía de esta temperatura, el metabolismo normal y el crecimiento de las células se verán afectados o incluso morirán. En general, las células cultivadas son más tolerantes a las bajas temperaturas que a las altas. Cuando la temperatura no supera los 39°C, la intensidad del metabolismo celular es proporcional a la temperatura; si las células se cultivan en un ambiente de 39~40°C durante 1 hora, sufrirán algún daño, pero aún pueden recuperarse; cuando la temperatura supera los 43°C, muchas células morirán. Cuando la temperatura desciende a 30~20°C, el metabolismo celular disminuye, reduciendo así el intercambio de material con el medio de cultivo. Lo primero que se observa es un cambio en la morfología celular y un desprendimiento de las células de la matriz. Cuando los cultivos regresan a su temperatura de cultivo original, su morfología y metabolismo originales también regresan a sus niveles originales.
2. Cultivo adherente (cultivo de apego)
Se refiere al cultivo de células adheridas a una determinada superficie sólida.
1. Características de crecimiento: las células dependientes de la adhesión deben adherirse a la pared del recipiente de cultivo (botella) durante el cultivo. Una vez que las células se adhieren a la pared, se propagarán rápidamente, luego comenzarán la mitosis y rápidamente. entrar en un período de crecimiento logarítmico. Generalmente, al cabo de unos días, la superficie del cultivo quedará cubierta y se formará una densa monocapa de células.
2. Ventajas del cultivo adherente:
Es fácil cambiar el medio de cultivo; las células se adhieren estrechamente a la superficie sólida y el medio de cultivo antiguo se puede verter directamente. y se puede agregar un nuevo medio de cultivo directamente después de la limpieza.
Es fácil utilizar el cultivo de perfusión para lograr el propósito de aumentar la densidad celular; debido a que las células están fijadas en la superficie, no se requiere ningún sistema de filtración.
Cuando las células se adhieren a una matriz de crecimiento, muchas células expresarán un producto de forma más eficiente.
Un mismo equipo puede utilizar diferentes ratios medio de cultivo/célula.
Apto para todo tipo de células.
3. Desventajas del cultivo adherente: en comparación con el método de cultivo en suspensión
Es más difícil expandir el cultivo y la inversión es grande;
Requiere un área grande;
No se puede controlar eficazmente el crecimiento celular;
4. La superficie a la que se adhieren las células: requiere una carga neta positiva y un alto grado de actividad superficial. Los microportadores también requieren una cierta densidad de carga; si son superficies orgánicas, deben ser hidrófilos y estar cargados positivamente.
5. Sistema de cultivo adherente: incluye principalmente matraz giratorio, fibra hueca (descrito más adelante), perlas de vidrio, sistema de microportador (descrito más adelante), etc.
Sistema de cultivo en matraz giratorio: Las células dependientes de la adherencia se cultivaron inicialmente utilizando un sistema de matraz giratorio. El cultivo en matraz giratorio se utiliza generalmente en la etapa de transición del cultivo a pequeña escala al cultivo a gran escala, o como una forma de preparar células para la inoculación en biorreactores. Las células se inoculan en un recipiente de cultivo cilíndrico giratorio: una botella giratoria. Durante el proceso de cultivo, la botella giratoria se gira continuamente para que las células queden expuestas alternativamente al medio de cultivo y al aire, proporcionando así mejores condiciones de transferencia de masa y de calor.
El cultivo en botellas giratorias tiene las ventajas de una estructura simple, baja inversión, tecnología madura, buena repetibilidad y la amplificación solo requiere aumentar el número de botellas giratorias. Pero también tiene sus desventajas: alta intensidad de mano de obra, gran espacio, pequeña superficie para el crecimiento celular por unidad de volumen, baja densidad de crecimiento celular y limitaciones en el seguimiento y control de las condiciones ambientales durante el cultivo. Los sistemas de cultivo de botellas rotativas que se utilizan actualmente incluyen incubadoras de dióxido de carbono y máquinas de botellas rotativas.
En este método de cultivo, las células se adhieren a una superficie fija y crecen sin agitarse ni fluir con el medio de cultivo, por lo que es más fácil cambiar el medio de cultivo y no se requiere ningún equipo especial de separación de las células. y el medio de cultivo puede usar cultivo de perfusión para obtener una alta densidad celular y obtener un producto de manera efectiva; sin embargo, es difícil expandir la escala y no puede monitorear directamente el crecimiento de las células, por lo que se usa principalmente para preparar productos biofarmacéuticos con dosis pequeñas y alto valor; .
Los reactores CelliGen, CelliGen PlusTM y Bioflo3000 son biorreactores de cultivo adherentes de uso común. Se pueden utilizar sistemas de agitación de cesta y soportes en forma de disco para el cultivo adherente de células. Este soporte es un disco de fibra de poliéster no tejido de 6 mm de diámetro con una alta relación entre área superficial y volumen (1200 cm2/g), lo que favorece la consecución de una alta densidad celular. El sistema de agitación en cesta y el cultivo portador son actualmente los métodos más utilizados para el cultivo de células adherentes y se utilizan para cultivar células de hibridoma, células Hela, células 293, células CHO y otras células. Las células se cultivan de esta manera y se adhieren rápidamente después de sembrarlas.
3. Cultivo en suspensión (cultivo en suspensión)
Se refiere al proceso en el que las células crecen libremente suspendidas en un reactor. Se utiliza principalmente para cultivos celulares independientes de la adhesión, como células de hibridoma, etc.; se desarrolló sobre la base de la fermentación microbiana.
El cultivo en suspensión sin suero es un método de cultivo celular que utiliza proteínas u hormonas de origen humano o animal conocido para reemplazar el suero animal. Puede reducir el trabajo posterior a la purificación y mejorar la calidad del producto. Método principal para células animales. Nuevas direcciones de investigación en cultivo a escala.
4. Cultivo de inmovilización (cultivo de inmovilización)
Consiste en combinar células animales con portadores insolubles en agua y luego cultivarlas. Ambos tipos de células mencionados anteriormente son adecuados. Tienen las ventajas de una alta densidad de crecimiento celular, una fuerte resistencia a la fuerza de corte y anticontaminación. Las células son productos fáciles de separar, lo que favorece la separación y purificación de productos. Existen muchos métodos de preparación, incluido el método de adsorción, el método de unión de iones valentes, el método de reticulación ion/ion-valente, el método de inclusión, el método de microencapsulación, etc.
1. Método de adsorción: El método de utilizar un adsorbente sólido para adsorber células en su superficie para inmovilizarlas se llama adhesión. Es fácil de operar y tiene condiciones suaves. Es el método investigado más antiguo utilizado en la inmovilización de células animales. Las desventajas son: el soporte tiene poca capacidad de carga y las celdas se caen fácilmente. El cultivo de microportadores y el cultivo de fibras huecas son representantes de este método, que se presentará más adelante.
2. Método de unión covalente: El método de inmovilización que utiliza enlaces covalentes para combinar células animales con portadores en fase sólida se denomina unión por enlace covalente. Este método puede reducir la fuga de células, pero requiere la introducción de reactivos químicos, lo que tiene un impacto en la actividad celular. Además, debido a la unión, el límite de difusión es pequeño y las células no están protegidas.
3. Método de reticulación ion/iónica: los reactivos bifuncionales tratan la suspensión celular, que formará puentes entre las células y floculará para producir efectos de reticulación. Este método de inmovilización de células se llama ion/reticulación. unión por enlace covalente. Los reactivos de reticulación provocan cierta muerte celular y también pueden provocar limitaciones en la difusión.
4. Método de atrapamiento: El método de incrustar células dentro de un soporte poroso para formar células inmovilizadas se llama atrapamiento. Las ventajas son: pasos simples, condiciones suaves, gran capacidad de carga, menos fugas de celda y resistencia al corte mecánico. Las desventajas son: limitaciones de difusión, no todas las células tienen una concentración óptima de matriz y la matriz macromolecular no puede penetrar en el interior de la red polimérica.
Generalmente adecuados para la inmovilización de células independientes del anclaje, los vehículos comúnmente utilizados son geles porosos, tales como gel de agarosa, gel de alginato cálcico y fibrina.
5. Microencapsulación: Se utiliza una capa de membrana semipermeable hidrófila para rodear las células en microcápsulas en forma de cuentas. Las células no pueden escapar, pero las moléculas pequeñas y los nutrientes sí pueden acceder a la membrana semipermeable. Es un entorno de microcultivo, similar al cultivo líquido, que puede proteger las células del daño, por lo que las células crecen bien y tienen una alta densidad. El diámetro de las microcápsulas se controla preferentemente entre 200 y 400 µm. Se debe prestar atención a la preparación:
Es suave, rápida, no daña las células y funciona en condiciones líquidas y fisiológicas tanto como sea posible;
Los reactivos y materiales de la membrana utilizados no son tóxicos para las células;
El tamaño de los poros de la membrana se puede controlar y debe permitir que los nutrientes y metabolitos pasen libremente;
La membrana debe tener suficiente resistencia mecánica para resistir la agitación durante la cultura.