¿Cuáles son los principios y procedimientos básicos para preparar anticuerpos monoclonales? ¿Cuál es el punto?
Bajo la estimulación del antígeno, los linfocitos B pueden diferenciarse y proliferar para formar anticuerpos específicos contra el antígeno. La capacidad y el número de células B son limitados y no pueden seguir diferenciándose y proliferando, por lo que su capacidad para producir inmunoglobulinas es extremadamente pequeña. Esta célula B se fusiona con células de mieloma no secretoras para formar células de hibridoma, que luego se clonan. Esta célula de hibridoma clonada no sólo tiene la capacidad de desarrollar tumores de forma indefinida, sino que también tiene la capacidad de producir linfocitos B con anticuerpos específicos. Al cultivar o inyectar estas células de hibridoma clonadas en ratones, se pueden obtener grandes cantidades de anticuerpos de alto título y específicos. Esta tecnología se llama tecnología de anticuerpos monoclonales.
Proceso de preparación de anticuerpos monoclonales:
Inmunización de animales
Inmunización de animales es el proceso de inmunizar ratones con antígenos diana para producir linfocitos B sensibilizados. Normalmente, se seleccionan ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad y se inmunizan según un programa de inmunización preestablecido. Los antígenos ingresan a los órganos inmunes periféricos a través de la circulación sanguínea o linfática, estimulando la clonación, activación, proliferación y diferenciación de los linfocitos B correspondientes en linfocitos B sensibilizados.
Fusión celular
Matar al ratón con gas dióxido de carbono, extraer el bazo asépticamente, exprimirlo y triturarlo en una placa de cultivo para preparar una suspensión de células del bazo. Las células de mieloma singénicas preparadas y las células de bazo de ratón se mezclaron en una determinada proporción y se añadió el promotor de fusión polietilenglicol. Bajo la acción del polietilenglicol, varios linfocitos pueden fusionarse con células de mieloma para formar células de hibridoma.
Cultivo selectivo
El objetivo del cultivo selectivo es cribar células de hibridoma fusionadas, generalmente utilizando medio de cultivo selectivo HAT. En el medio HAT, las células de mieloma no fundidas mueren porque carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa y no pueden sintetizar ADN por medios de recuperación. Aunque los linfocitos no fusionados tienen hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa, no pueden sobrevivir durante mucho tiempo in vitro y mueren gradualmente. Sólo las células de hibridoma fusionadas pueden sobrevivir y proliferar en medio HAT porque obtienen hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa de los esplenocitos y poseen las características de las células de mieloma que pueden proliferar indefinidamente.
Cribado y clonación de clones positivos para hibridoma
Sólo unas pocas células de hibridoma cultivadas en medio HAT secretan anticuerpos monoclonales con una especificidad predeterminada, por lo que deben ser cribadas y clonadas. El método de dilución limitante se utiliza habitualmente para clonar células de hibridoma. Utilizando métodos inmunológicos sensibles, rápidos y específicos, se seleccionan, clonan y amplifican células de hibridoma positivas que pueden producir los anticuerpos monoclonales necesarios. Después de una identificación exhaustiva del tipo, subtipo, especificidad, afinidad, epítopo, peso molecular, etc. de la inmunoglobulina de los anticuerpos monoclonales secretados, se congelan y almacenan de manera oportuna.
Preparación a gran escala de anticuerpos monoclonales
Un gran número de anticuerpos monoclonales se preparan principalmente mediante inducción en animales y cultivo in vitro.
Inducción in vivo (1) ratones BALB/c. Primero, se inyectaron por vía intraperitoneal 0,5 ml de parafina líquida o norfitano como pretratamiento. 1-2 semanas después, se inocularon células de hibridoma en la cavidad peritoneal. Las células de hibridoma proliferan en la cavidad abdominal de los ratones y producen y secretan anticuerpos monoclonales. En aproximadamente 1 a 2 semanas, el abdomen del ratón aumenta de tamaño. Se puede obtener una gran cantidad de anticuerpos monoclonales extrayendo líquido ascítico con una jeringa.
(2) Método de cultivo in vitro, las células de hibridoma se cultivan en frascos de cultivo. Durante el proceso de cultivo, las células de hibridoma producen y secretan anticuerpos monoclonales. El sobrenadante del cultivo se recoge y se centrifuga para eliminar las células y sus restos para obtener los anticuerpos monoclonales necesarios. Sin embargo, la cantidad de anticuerpos producidos por este método es limitada. Constantemente surgen nuevas tecnologías y equipos de cultivo que mejoran enormemente la producción de anticuerpos.
La importancia de la preparación de anticuerpos monoclonales:
Se utiliza en experimentos posteriores de ciencias biológicas y tiene valor médico.
(1) Reacción de precipitación: Reacción de precipitación
(2) Prueba de aglutinación: Hemaglutinación
(3) Utilizar radioinmunoensayo para detectar complejos inmunes.
(4) Citómetro de flujo: utilizado para la tipificación y separación celular.
(5) Detección inmunológica, como 5) ELISA
(6) Biosensor BIAcore: detecta Ab-Ag o su afinidad con proteínas.
(7) Método de transferencia Western
(8) Inmunoprecipitación:
(9) Cromatografía de afinidad: proteínas separadas.
Usa (10) perlas magnéticas para la separación celular
(11) Diagnóstico y tratamiento de enfermedades clínicas;