El número de casos confirmados en Estados Unidos supera los 1,69 millones

El citomegalovirus (CMV) es un virus del herpes que se encuentra ampliamente distribuido. La infección por CMV puede causar lesiones en el sistema genitourinario, sistema nervioso central, hígado, pulmones y sistema circulatorio sanguíneo, y puede estar relacionada con la aparición de tumores malignos. Nuevo informe de SIDA, la infección por citomegalovirus puede estar relacionada. A menudo se transmite a través de las relaciones sexuales. Por lo tanto se clasifica como una enfermedad de transmisión sexual.

En un rango más amplio de personas, la infección por citomegalovirus puede causar lesiones en diversos órganos y tejidos de todo el cuerpo, provocando daños graves a fetos y bebés, e incluso la muerte, y puede estar asociada con la incidencia de tumores malignos. como el cáncer de cuello uterino. Por lo tanto, es muy importante comprender el CMV y prevenir activamente la infección por citomegalovirus.

[Patología]

CMV [Patógeno]

El virus de la saliva pertenece a la subfamilia Herpesvirinae, un grupo de virus llamados herpesvirus humanos. , compuesto por ADN lineal bicatenario con un peso molecular de aproximadamente 150X106. El más grande consta de 162 icosaedros de partículas de concha (capsómeros virales). Estructura típica del virus del herpes. Las formas del virus del herpes simple y del virus varicela-zóster son muy similares y difíciles de distinguir.

El CMV sólo puede proliferar en fibroblastos humanos en cultivo de tejidos, pero no puede crecer en otras células animales. La tasa de proliferación es muy lenta y su ciclo de replicación es de 36-48 horas, lo que lleva más de 8 horas. del ciclo de replicación del virus. El aislamiento inicial de las células especializadas llevó más de un mes, y las células se convirtieron en una extensión del parque, una célula y núcleo gigante, con un "halo" nuclear que rodea grandes inclusiones eosinófilas. Las células diana de los organismos vivos son las células epiteliales. Amplia reactividad cruzada entre varias cepas de citomegalovirus humanos.

CMV sobrevive hasta 2 horas en éter al 20%. Un pH <5, o colocarlo a 56°C durante 30 minutos, o 5 minutos de irradiación UV pueden ser suficientes para la inactivación. La infección por citomegalovirus es resistente a la congelación y descongelación, o el almacenamiento a -20°C o -50°C es inestable, y un 10% de lejía doméstica hace que sea mucho menos probable que infecte. La infección por CMV se caracteriza por las típicas inclusiones citoplasmáticas y nucleares de células gigantes, también conocidas como citomegalovirus. Mastocitos en tejido humano, que causan la enfermedad de inclusión de células gigantes.

La infección primaria en la patogénesis, el citomegalovirus, existe indefinidamente en estado latente en las células huésped. Se sugiere que los pulmones, el hígado, el páncreas, las glándulas salivales, el sistema nervioso central y los intestinos también pueden ser los lugares donde se esconde el virus y pueden estar involucrados en diversos tejidos y órganos. La gravedad de la infección congénita se asocia con la falta de anticuerpos precipitados y la capacidad de las células T para responder al CMV. La infección por citomegalovirus en la sangre periférica de niños y adultos suprime el fenotipo de linfocitos T citotóxicos activados. Si la función de las células T del huésped está alterada, el virus latente puede reactivarse y provocar diversos síndromes. Estimulación crónica de enfermedades causadas por la activación del citomegalovirus en el trasplante de tejidos. Algunos inmunosupresores potentes de células T, como la globulina antitimocítica, se utilizan en la alta incidencia del síndrome clínico por CMV. Además, CMV puede utilizar cofactores funcionales para permitir la reactivación de la infección por VIH latente.

Los pacientes infectados y sus fuentes de enfermedad infecciosa aguda son fuentes de infección humana. El citomegalovirus se ha encontrado en sangre, saliva, lágrimas, orina, semen, heces, secreciones cervicales y vaginales, leche materna y otros. La transmisión de leche, saliva y orina puede durar desde semanas hasta años.

Poblaciones susceptibles

Citomegalovirus En todo el mundo, las personas tienen un amplio rango de susceptibilidad. Los humanos son el único huésped del citomegalovirus.

Encuesta serológica: Tendencias estacionales en la prevalencia de anticuerpos contra citomegalovirus en adultos, 40-100%.

Las tasas de infección varían entre países y diferentes condiciones económicas. En Asia y África, el 90% de la población está infectada, la mayoría a una edad temprana, con anticuerpos, y la infección ocurre a una edad más temprana, mientras que en los países occidentales la infección ocurre más tarde. La encuesta también mostró que los grupos económicos y de ingresos y las personas de bajos ingresos tienen tasas de infección más altas. La tasa de positividad de anticuerpos de las personas de 70 años es más alta que la de las personas de 20 años. Las mujeres son más susceptibles a la enfermedad que los hombres entre 20 y 30 años, y que los hombres entre 50 y 60 años. Después de los 35 años, la tasa de positividad de anticuerpos entre hombres y mujeres es básicamente la misma. Aunque el cuerpo ha producido anticuerpos circulantes, el virus aún puede eliminarse de forma continua o intermitente, provocando así una infección crónica o latente.

La mayoría de las personas se infectarán por CMV a lo largo de su vida, pero se trata principalmente de una infección latente asintomática.

La infección por citomegalovirus y la función inmune están estrechamente relacionadas en los adultos. Los virus tienden a persistir durante toda la vida en forma de infección latente y resucitan sólo cuando el estado inmunológico del huésped está desequilibrado, como en los trasplantes de órganos y médula ósea, el cáncer, las matemáticas, el embarazo y las aplicaciones de inmunosupresores. La resurrección de virus latentes y de portadores asintomáticos puede provocar la propagación del virus. Los pacientes con SIDA que reciben trasplante de órganos y tratamiento inmunosupresor suelen tener una alta incidencia de morbilidad en los órganos y virus latentes que ingresan al torrente sanguíneo, o activación inmune de virus latentes e infección por citomegalovirus.

Métodos de transmisión del citomegalovirus:

(1) Infección congénita: Embarazo (infección intrauterina), el citomegalovirus se puede transmitir al feto a través de la placenta.

(2) Infección adquirida (infección perinatal): Durante el parto, el virus de las secreciones cervicales puede transmitirse al recién nacido a través del canal del parto.

(3) El virus de la secreción de leche posparto se puede transmitir directamente al bebé a través de la lactancia.

(4) La exposición prolongada, la desintoxicación, la saliva, la orina y las lágrimas pueden propagarse.

(5) La infección por CMV homóloga se puede transmitir mediante transfusión de sangre y trasplante de órganos. La infección singénica por CMV es un riesgo grave de infección por CMV después de una transfusión de sangre y un trasplante de órganos, múltiples transfusiones de sangre o un mayor riesgo de infección primaria y recurrente con transfusiones de sangre masivas, transfusión de sangre que contiene leucocitos, trasplante de órganos o de médula ósea. Los riesgos también son mayores. . Transmisión sexual

(6): dado que el virus suele estar presente en las secreciones del tracto urogenital, el semen o las secreciones cervicales pueden transmitirse directamente a través de las relaciones sexuales.

Por infección por semen, secreciones cervicales, lágrimas, heces (sexo oral, beso en el ano). Ruta de infección por citomegalovirus (anillo medio) Tabla 1

Madre a feto, recién nacido, niño, adulto

Infección vaginal, infección de contacto

(saliva, orina)

Transfusión de sangre

Hepatitis

Infección del tracto respiratorio Infección latente

Hepatitis

Infección del tracto respiratorio

>

→Neumonía y mucosas gastrointestinales causadas por inmunosupresores lentos, aumento de peso en niños con mala maduración

Hepatitis viremia

┌→No invasivo

│ BR />└→Infección- →Virus de la mononucleosis infecciosa en recién nacidos sanos con glucosa en orina positiva Virus de la mononucleosis infecciosa en

Enfermedad similar a la mononucleosis infecciosa → policitemia en viruria, disfunción hepática

Plaquetas transitorias/>transfusión de infección latente reducida

Fiebre inexplicable, infección asintomática

→enfermedad sistémica de inclusión de células gigantes

↓

, o signos de retraso mental

[Journal of Immunology

La infección por citomegalovirus puede causar la función inmune del cuerpo, especialmente la disminución de la función inmune celular. La infección por CMV tiene efectos significativos sobre la función del timo y los esplenocitos, los fagocitos mononucleares, las células NK y las células CTL.

El timo y el bazo de laboratorio de cobayas recién nacidos infectados con CMV agudo suprimieron el número de timo y células T en ratones adultos infectados con citomegalovirus, y la detección de citomegalovirus tímico fue del 88%.

La infección por citomegalovirus afecta la función del bazo y la actividad de proliferación de los linfocitos esplénicos se reduce. La ConA estimula a los esplenocitos para que produzcan IL-2, que se reduce significativamente.

Mononucleosis aguda de infección por citomegalovirus. La respuesta de proliferación mitótica de los linfocitos de sangre periférica, el antígeno del citomegalovirus y el antígeno del VHS se debilitó, se indujo el nivel de interferón y la proporción CD4/CD8 cayó a 1,7 ± 0,7 ± 0,2 + 0,2, lo que redujo la actividad de las células T. Algunos cambios duraron un período de tiempo considerable y, después de 10 meses de enfermedad, las proporciones del subconjunto de células T de la mayoría de los pacientes no habían vuelto completamente a la normalidad.

Los efectos inmunosupresores de la infección por citomegalovirus son causados ​​por la infección viral de monocitos grandes y la disfunción de las células CD8. Los fagocitos mononucleares desempeñan un papel fundamental en la inmunidad anti-CMV. No sólo pueden tragar y proteger directamente contra los virus, sino que, lo que es más importante, pueden procesar la respuesta inmunitaria, presentar antígenos, secretar, regular y expandir citocinas. Cuando la infección por CMV afecta la función de los fagocitos mononucleares, la infección por citomegalovirus provoca una disminución en la fagocitosis de los macrófagos, una disminución en los radicales libres de oxígeno intracelular, cambios en la expresión de los receptores FC, receptores del complemento y productos agrícolas de baja calidad en la presentación del antígeno. La función de IL-1 también se redujo al reducir las respuestas de IL-1 e IL-2. En el ensayo de proliferación de timocitos de Moses et al., la actividad de IL-1 se redujo y la producción reducida de IL-1 puede conducir a un desequilibrio en la proporción de células TH/TS.

Citomegalovirus se propaga por antagonismo de las células NK. Las células NK participan activamente en todo el proceso de infección anticitomegalovirus. La actividad de NK es alta, pero no necesariamente hay evidencia de una respuesta protectora, pero sí de infección activa. Las células NK no pueden proteger contra la aparición de una infección primaria por CMV, pero una vez infectadas, las células NK están presentes, lo que limita la propagación de la infección por CMV desde el principio y permite restringir la infección. Las células NK y las células CTL son células efectoras importantes contra el CMV. En las primeras etapas de la replicación del CMV, antes de que se produzcan viriones infecciosos, pueden escindir las células infectadas, lo que permite la propagación abortiva del virus entre las células. En el modelo de ratón, de 3 a 5 días después del impacto viral, el efecto antiviral mediado por las células NK se vio potenciado por la actividad de las células NK potenciada por IFN. Día 6-21, bazo, actividad de destrucción de células sanguíneas periféricas de CTL. La actividad de las células NK y CTL determina la sensibilidad del cuerpo a la infección por citomegalovirus y la facilidad de recuperación de la infección. La actividad de las células infectadas por citomegalovirus, las células NK y las células CTL también se ve gravemente afectada. Además, la inmunidad celular específica previene la recurrencia de la infección por CMV. fue detectar la aparición de respuestas de células T en receptores de trasplantes de riñón infectados por CMV y encontró que 20 de 14 respuestas citotóxicas al CMV, y 6 respondedores citotóxicos tuvieron consecuencias clínicas graves. Por tanto, la presencia de una célula T específica previene la recurrencia de la infección por CMV.

El cuerpo reduce la virulencia de la infección por CMV causada por la infección por CMV y puede haber una variedad de anticuerpos. Leche, secreciones cervicales, saliva, aunque anticuerpos específicos, incluidos los anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, seguir detectando anticuerpos contra el CMV no previene la propagación del virus. No impide que el feto intrauterino adquiera pasivamente anticuerpos de la madre, propagando la infección al canal del parto o a la leche. Los estudios han demostrado que 0,2 ml de globulina anti-CMV de alto título pueden proteger completamente a los animales de la muerte antes de una exposición fatal al CMV mediante inyección intraperitoneal o intravenosa en ratones. CMV, etc., y luego la exposición secundaria, todos los animales sobrevivieron, lo que indica el papel de los anticuerpos en la reducción de la virulencia del citomegalovirus.

¿Qué pasará si las mujeres embarazadas se infectan con citomegalovirus?

Las mujeres embarazadas están infectadas con citomegalovirus. El virus puede infectar al feto a través de la placenta, provocando infección congénita del feto, aborto espontáneo y muerte fetal.

Los bebés que nacen con una infección congénita pueden ser asintomáticos, pero los casos graves pueden afectar múltiples órganos e incluso provocar la muerte. Los síntomas incluyen hepatoesplenomegalia, ictericia, petequias o púrpura trombocitopénica idiopática, coriorretinitis y microcefalia. Todos los niños vivirán con distintos grados de pérdida de audición, visión, conciencia, deterioro motor, retraso mental y otros. Las infecciones a través del canal del parto o la lactancia después del parto son infecciones adquiridas, generalmente con síntomas leves, buen pronóstico y anomalías de la función hepática individual.

[Manifestaciones clínicas]

¿Cuáles son los síntomas de la infección por citomegalovirus?

La infección por citomegalovirus en adultos sanos a menudo no presenta síntomas clínicos evidentes. Algunos pacientes pueden presentar mononucleosis infecciosa, fiebre, fatiga, dolor de garganta, inflamación de los ganglios linfáticos, dolor muscular y polineuropatía atípica en la sangre periférica. linfocitos y esplenomegalia.

La infección intrauterina durante el embarazo puede dañar al feto, siendo propenso al aborto espontáneo y a la muerte fetal o al parto prematuro. Los síntomas neonatales incluyen hepatoesplenomegalia, ictericia, hepatitis, púrpura trombocitopénica, anemia hemolítica, degeneración del sistema nervioso, microcefalia, retraso mental y discapacidad visual y auditiva.

La infección neonatal puede no presentar síntomas sistémicos, algunos pueden mostrar solo síntomas de insuficiencia respiratoria y otros pueden tener una función hepática anormal. No hubo daño neurológico.

La historia natural de la infección por CMV es muy compleja, con desintoxicación después de la infección primaria, a menudo semanas, meses o incluso años, y luego una infección latente. Las infecciones suelen reaparecer y luego se desintoxican. Incluso después de muchos años de infección primaria, el virus latente puede reactivarse y la reinfección puede tener diferentes cepas de virus antigénicos. Las manifestaciones clínicas de la infección por citomegalovirus están relacionadas con la función inmune del individuo y la edad. Como se muestra en el Cuadro 2, los signos y síntomas de infección, ya sea por transmisión vertical, transmisión paralela o infección adquirida en el hospital, son variados.

Tabla 2 Evolución clínica de las enfermedades infecciosas por CMV y tipos de enfermedad (Baerlocher)

Tipos graves: ictericia, anemia, hepatoesplenomegalia, trombocitopenia, recién nacidos infectados (congénitos)

Púrpura reducida, alteración del sistema nervioso central, neumonía, miocarditis)

B. Tipo leve: animación suspendida, hipertrofia cardíaca, hiperbilirrubinemia

2. Reinfección por CMV durante el período asintomático posterior al nacimiento y durante la lactancia (¿congénita/adquirida?)

A. Sistémica

B. Respiratorio (parecido a la tos ferina) tipo C. Hepatoesplenomegalia

. ¿Tipo gastrointestinal o renal?

3. Tipo adquirido

1. Tipo de gripe

B. Tipo mononucleosis Tipo respiratorio

D. Hepatitis gastrointestinal E

F. Debido a la baja capacidad de defensa médica especial

grama. ¿Tipo asintomático?

Consecuencias a largo plazo de 4.1,2,3 con respecto a la adquisición de infección por citomegalovirus, comúnmente observada después de la transfusión de células mononucleares en la histiocitosis clínica, debido a disfunción inmune, retraso mental y motor

Inflamación vascular, retiniana, neumonía e infecciones gastrointestinales. La mayoría de los pacientes con síndrome de Grid-Barre.

[Diagnóstico]

Las manifestaciones clínicas de la infección por citomegalovirus no pueden diagnosticarse y deben depender del laboratorio para referirse a un virus aislado de muestras clínicas (o un aumento de más de 4 veces en anticuerpos específicos o títulos de anticuerpos sostenidos) para confirmar el diagnóstico.

Aislamiento de virus

Mejor saliva, orina, secreciones del tracto reproductivo, leche materna y glóbulos blancos, inoculados en fibroblastos humanos para su propagación y aislamiento, efectos citopáticos (el CPE se puede observar días o semanas después de la fijación de células gigantes y la tinción con HE, las inclusiones intranucleares, los halos perinucleares y las inclusiones intracitoplasmáticas eosinófilas, muy parecidas a los "ojos de búho" (ojos de búho)) también se pueden controlar utilizando métodos como la tinción con anticuerpos monoclonales o policlonales.

Los dos más utilizados son la detección de anticuerpos séricos del complemento

Prueba integral (CF), inmunofluorescencia indirecta (IIF), prueba de inmunoenzima (EIA), prueba de hemaglutinación indirecta Pruebas para CMV- Anticuerpos IgG e IgM (IHA) y radioinmunoensayo (RIA). Al tomar una única muestra de suero para determinar el historial de infección por CMV, debe dejar la muestra de suero inmediatamente y a intervalos de 2 semanas, 4 semanas y 8 semanas, y luego dejar la muestra de suero aislada del virus combinado que puede usarse para diagnosticar infección primaria.

Sondas de ADN

La sonda de CMV marcada con 32P se ha utilizado ampliamente en la detección de mayor sensibilidad en algunas muestras, siendo un método más sensible que el aislamiento del virus.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

(1) Recogida y procesamiento de muestras

Recoja muestras, incluida la sangre, la orina y el tejido glandular del paciente. Las capas leucocitarias (capas leucocitarias) preparadas a partir de sangre completa se pueden almacenar a -80 °C; las muestras de orina se pueden almacenar en nitrógeno líquido; Las muestras criopreservadas deben evitar la congelación y descongelación repetidas.

Centrifugar la muestra de orina a 2500 r/min durante 10 minutos para eliminar los restos celulares y recoger el sobrenadante. La orina pretratada contiene inhibidores de la PCR según sea necesario polietilenglicol (PEG6000): 50? L sobrenadante de orina y 50? ¿L es 20% PEG6000 y 25? L-2 mol/L de NaCl, mezclar y poner en un baño de hielo durante 6 horas; centrifugar a 15000 r/min durante 30 minutos para recoger el precipitado. Centrifugar a 6400 r/min durante 3 minutos; aspirar tanto como sea posible para eliminar el sobrenadante y suspender el precipitado en agua destilada. La suspensión se puede utilizar directamente para la amplificación por PCR. La amplificación debe realizarse calentándola a 100 °C durante 10 minutos y luego enfriándola en un baño de hielo de fraguado rápido.

(b) Plantilla de ADN preparada

1.

Plantilla de preparación de muestra de sangre ADN

A: agregue NaCl para que la concentración sérica final de glucosa sea 150 mmol/L; lEste suero se somete directamente a amplificación por PCR a 70°C durante 45 segundos.

Método B: Preparar la capa leucocitaria (BCP): (1) Recoger el BCP y lavar el precipitado dos veces con PBS. ②¿Únete a 500? Se homogeneizan \sim 6 mol/l de clorhidrato de guanidina. ③¿Agregar 30? ?10 mmol/L EDTA, 10 mmol/L cloruro de sodio, 30? L20% lauril sarcosinato de sodio y 5? ,? Proteinasa K (10 mg/ml), mezclar, reaccionar a 60°C durante 1 hora. ④¿Unirse a 1130? L precipitación con etanol durante 1 hora, -20°C. ⑤Recoja el ADN precipitado mediante centrifugación. ⑥ Lavar dos veces con etanol al 70% y finalmente suspender el sedimento en una pequeña cantidad de Tris-HCl 10 mmol/L y EDTA 1 mmol/L. Reservar a 4°C.

2. Preparación de plantilla de ADN a partir de muestras de tejido congeladas: ① ¿La máquina criostática está cortando de 5 a 10? Coloque bloques de tejido congelados en tubos de plástico de 1,5 ml. (2) Agregue una solución de formalina al 10 % al tampón de preparación. ③Después de 10 minutos y de 1 a 2 minutos, verter suavemente el sobrenadante, centrifugar, precipitar con etanol y lavar dos veces. ④ Secar a temperatura ambiente durante 10 a 60 minutos. ⑤Agregue tampón de extracción (100 mmol/L Tris-HCl, 4 mmol/L EDTA, pH 8,0, 400 G/ml proteinasa K) para sumergir apenas el sedimento (aproximadamente 50 a 100·L). Triture el sedimento. El tejido incluido en parafina y fijado con formalina se desparafina y se seca; haga clic aquí. ⑥ Colocar en líquido a 37 ℃. ⑦ Colocar en agua hirviendo durante 7 minutos para inactivar la proteinasa K ⑧ Recoger el sobrenadante por centrifugación, tomar de 1 a 10? L puede amplificarse por PCR.

3. Plantilla de preparación de muestra de orina ADN: ①100? ¿Usar 100 para L de sobrenadante de orina? litro 6 mol/L isotiocianato de guanidina, 7? l 2mol/L NaCl y 20? Se mezcló una suspensión de polvo de vidrio L (DNA PREP, Asahi Glass Co., Ltd., Tokio, Japón). (2) Agitar a temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugar a 6400 r/min durante 2 minutos y recoger el precipitado. ③ Lavar el precipitado una vez con etanol al 50%, Tris-HCl 10 mmol/L y NaCl 50 mmol/L a pH 7,4 y centrifugar a 6400 r/min durante 1 minuto. ④ Lavar el mismo precipitado dos veces con agua y recoger el precipitado. ⑤¿Agregar 50? L de agua destilada a 55°C durante 15 minutos. ⑥Centrifugar a 15000 r/min durante 2 minutos, recoger el sobrenadante (incluido el ADN del citomegalovirus) y realizar la amplificación por PCR. Calentar la suspensión a 100 °C durante 10 minutos y enfriarla rápidamente en un baño de hielo.

(3) Cebadores y sondas

El diseño de cebadores y sondas se basa en los cuatro exones publicados de la región promotora del gen de la proteína temprana inmediata del citomegalovirus. El comienzo de la subsecuencia, el gen del antígeno tardío gp64 y la secuencia del gen de la proteína fosforilada pp71. Los cebadores y sondas de uso común se enumeran en la Tabla 3.

(4) Paso de amplificación por PCR

Tampón de reacción 1,10×: Tris-HCl 100 mmol/l, pH 8,4, KCl 500 mmol/l, cloruro de magnesio 25 mmol/l, 2 mg/ml de gelatina.

Taq ADN polimerasa: 5U/? Elevar.

Concentración de 10×dNTP: 2,0 mmol/L de cada uno de los 4 tipos de dNTP.

Imprimación: 100pmol/L

2. ¿Amplificación por PCR convencional

Mezcla de reacción con tampón de reacción 10X (50 L)? Tamaño grande

¿10×dNTP? ?

5 de ADN molde? l

¿Taq ADN polimerasa 0.2? ¿Litros (UI)

0,5 por cada imprimación? Litro

Agua destilada 3,8? Litro

Añadir de 1 a 2 gotas de aceite mineral.

La mezcla de reacción se calentó a 94 °C durante 5 min, luego 30 s a 95 °C, 40 s a 55 °C y 60 s a 72 °C durante 35 a 40 ciclos de amplificación.

Tabla 3 Cebadores y sondas para amplificación por PCR de CMV

Cebadores

Sondas

Secuencia (5'→3') Posición

Fragmento

Tamaño

IE1 CCACCCGTGTGCCAGCTCC

Gen temprano

159 (BP)

IE2

CCCGCTCCTCCTGAGCACCC

IE3 (sonda)

CTGGTGTCACCCCCAGAGTCCCCTGTACCCGCGACTATCC

LA1

CCGCAACCTGGTGCCCATGG

Gp64 tardío 139

LA2 CGTTTGGGTTGCGCAGCGGG

LA3 (sonda)

TTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTACCGCATCTTCGCCG Exón 1 /> 139

IE1b

GGAATCCGCGTTCCAATGCA

IE1a

AGATCGCCTGGAGACGCCAT

Temprano

/> IE2a

ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG

Exón 2 temprano

72

IE2b

CCGTGGCACCTTGGAGGAAG

IE3a

> GTGACCAAGGCCACGACGTT

Exón principios de marzo

167

IE3b

TCTGCCAGGACATCTTTCTC

IE4a

ACAGATTAAGGTTTCGAGTGC

Exón principios de abril

179

IE4b

CAATACACTTCATCCTCCTCG

IE4c

TTACCAAGAACTCAGCCTTC

Gen temprano exón 4

> 158

IE4d

GTGCGTGAGCACCTTGTCTC

IE4e TATACCCAGACGGAAGAGAAATTCA

Gen temprano exón 4

426

IE4f

ATAAGCCATAATCTCATCAGGGGAG

PP1A

TAGCGCGCATACATCCCGAGTACAT

316

Pp1b

ATGACGTTGCTCCGGTGGAAAGAGACC

Pp71

3. Amplificación por PCR con funda (anidada): ① La mezcla de reacción contiene la misma composición (2), solo los cebadores IE2a e IE4b (incluido el 721B completo del exón 3), 100 pmol cada uno. Amplifique durante 20 ciclos a 94°C durante 60 segundos, 150 segundos a 52°C y 72°C durante 480 segundos. ②¿Tomar 2? Para el producto de amplificación de L, se agregaron 100 pmol de reactivos adicionales IE3a e IE3b a cada cebador. Luego, amplifique durante 20 ciclos a 94°C durante 60 segundos, 150 segundos y 52°C y 72°C durante 180 segundos.

(e) Identificación del producto

Los productos para el análisis de amplificación pueden ser pruebas de hibridación en fase sólida y pruebas de hibridación en fase líquida (membranas).

1. Hibridación en fase sólida:

① Prehibridar con 3×SSPE, 5×Denhardt, 0,5% SDS y solución de formamida al 25%. Los productos amplificados de la membrana se prehibridaron a 42°C durante 30 a 60 minutos. ②Agregue la sonda etiquetada (10cpm/G, 2ng/ml) y mezcle durante 30 a 60 minutos. ③ Lave la membrana con 0,2×SSPE 0,01% SDS a temperatura ambiente 3 veces, 5 minutos/tiempo, lave a 60 °C, 10 minutos/tiempo y luego lave a temperatura ambiente más de una vez, 5 minutos/tiempo. ④Autorradiografía.

2. Hibridación en fase líquida y electroforesis en gel:

① Tome 1/10 del volumen del producto de amplificación y mézclelo en la sonda de 0,5 a 1,0 pmol. ②Agregue NaCl con una concentración final de 150 mmol/L de glucosa, 10 mmol/L, sodio, ácido fosfórico y 1 mmol/L de solución de EDTA para obtener un volumen total de 20? ③95 ℃ durante 10 minutos, luego a 56 ℃ durante 60 minutos. ④Centrifugar el tampón de muestra agregado durante 10 segundos y realizar electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8%. ⑤Una vez completada la electroforesis, se tiñe con bromuro de etidio y luego se expone a una película de rayos X para la autorradiografía.

La secuencia de bases de la molécula de ADN del HCMV aún no ha sido descubierta. Aunque tiene un polimorfismo de longitud de fragmento de endonucleasa de restricción en su ADN, su discreción en el genoma no está clara. Utilizando un único par de cebadores para la amplificación por PCR, se puede identificar el 90% de las cepas de citomegalovirus humano de tipo salvaje, mientras que utilizando más de dos conjuntos de cebadores con diferentes secuencias de HCMV, se pueden detectar casi todas las cepas. Por tanto, en este caso, la PCR se realiza con dos o más de dos pares de cebadores situados en diferentes regiones del genoma.

Durante el proceso de preparación del ADN molde del HCMV, a veces se producen algunos pequeños fragmentos de ADN y la reacción de PCR a menudo da como resultado un cierto grado de productos de fondo, lo que afecta los resultados de la medición. En este caso, se puede utilizar el método de PCR anidada. El principio básico es que la amplificación del ADN objetivo se divide en dos pasos: primero, se utilizan un par de cebadores para amplificar el ADN objetivo, incluidos los fragmentos largos de ADN, y luego se toman. una pequeña cantidad Utilice cebadores para amplificar el ADN objetivo y luego amplifique el producto por segunda vez. Al controlar el número de ciclos de amplificación en cada paso, se evitan los falsos positivos causados ​​por pequeños fragmentos de ADN. Este método también evita resultados falsos negativos.

La detección por PCR de muestras de HCMV tiene una alta sensibilidad. Se pueden detectar secuencias de ADN viral equivalentes a docenas de moléculas de ADN viral o 1,5 PFU en el sobrenadante de un cultivo de tejidos infectados por HCMV. Los productos de amplificación se pueden detectar mediante análisis de hibridación Southern de muestras de orina al nivel de 1 pg de secuencia de ADN de HCMV; utilizando este sistema, el genoma viral en solo 4 × 104 células se puede detectar con sondas de oligonucleótidos no radiactivos, aumentado 2 × 103 veces; en comparación con la hibridación por transferencia puntual.

La tecnología de PCR tiene valor clínico para detectar la infección por HCMV porque el ADN viral en los fluidos corporales antes de la aparición de síntomas clínicos o evidencia serológica de infección puede usarse como un indicador temprano de la infección por HCMV. La infección por HCMV se transmite a través de la placenta y la infección del canal del parto, y la tasa de mortalidad de los recién nacidos infectados es mayor. Por lo tanto, también son importantes el diagnóstico temprano y el tratamiento oportuno mediante PCR, así como la atención prenatal y posnatal. La relación entre HCMV y muchas enfermedades graves también se puede identificar utilizando este método como donantes de órganos o tejidos. Además, los ensayos de PCR son indicadores de estabilidad pero también tienen análisis semicuantitativos y, por lo tanto, pueden usarse como medio para evaluar la eficacia de varios antivirales.

[Tratamiento]

Si se detecta una infección primaria por citomegalovirus al principio del embarazo, se debe interrumpir el embarazo lo antes posible. En caso de infección al final del embarazo, se deben controlar más a fondo las malformaciones fetales y se deben tomar las medidas de tratamiento correspondientes. Signos clínicos de terapia antiviral o enfermedad congénita por citomegalovirus. Como la citarabina, los glucósidos de sulfonamida, como el interferón, pero el efecto aún debe observarse más a fondo.

Trata la infección por citomegalovirus, pudiendo aplicarse diversos preparados antivirales como GCV, preparados de inmunoglobulinas anticitomegalovirus, interferones y factores de transferencia.

Sin embargo, estos medicamentos no resuelven fundamentalmente el problema y, a menudo, repuntan después de su abstinencia. Este virus latente puede usarse como una de las causas del SIDA, y los estudiosos de diferentes países están comprometidos a controlar su infección. Los científicos estadounidenses han desarrollado recientemente dos vacunas vivas que resultaron bastante eficaces después de la primera prueba. Uno está elaborado a partir de la cepa del virus AD169 y el otro a partir de la cepa Zhen, que ha demostrado claramente que la eficacia contra el citomegalovirus aumenta después de la administración parenteral, mejorando así la función inmune del cuerpo.

[Prevención]

El citomegalovirus representa un gran peligro para los humanos, por lo que debemos prevenir activamente su aparición.

(1) Ejercitar la conciencia de la condición física. Mejorar la función inmune del cuerpo y la resistencia a las enfermedades, especialmente en las mujeres en edad fértil, para reducir el daño grave del citomegalovirus al feto.

(2) Necesitamos proteger a las pacientes que están embarazadas o que padecen enfermedades debilitantes crónicas y tienen una función inmune baja y mantenerlas alejadas de fuentes de infección.

(3) Prestar atención al saneamiento ambiental, la alimentación y la salud.

(4) No se debe realizar la lactancia materna si el citomegalovirus en la leche es positivo.

(5) Prevención inmunológica. Todavía en investigación y exploración.

Los síntomas clínicos, la edad, el estado físico del paciente y la vía de infección varían mucho.

Para continuar...

Actualmente no existe ningún tratamiento eficaz para la infección por CMV.

Debido a la infección congénita por citomegalovirus y la carcinogénesis, algunos estudiosos creen que las vacunas pueden prevenir la infección por CMV. Debido a limitaciones técnicas, pero también a la incapacidad de cultivo, económica y práctica, y al alto precio, la aplicación de la vacuna eficaz contra el CMV se denominó vacuna municipal viva atenuada.

Referencias:

¿Conoce al culpable de la infección por citomegalovirus latente teratogénica?

El citomegalovirus humano (CMV) es un virus de ADN de doble cadena, uno de los virus animales de mayor tamaño. Las personas están infectadas únicamente con citomegalovirus humano. Debido a que la virulencia del citomegalovirus humano es más débil que la de otros virus, generalmente no invade los órganos y tejidos del cuerpo humano y causa daños graves, pero la integración de genes virales en óvulos fertilizados puede prevenir o afectar la replicación y