Principio de la PCR del cebador degenerado

1. ¿Cuál es la diferencia entre los cebadores degenerados, los cebadores específicos y los cebadores 16s? ¿Se pueden ver las bandas usando sus productos de PCR? 2. ¿Cómo calcular el valor de TM de los cebadores degenerados? utilizar Primer5.0 para diseñar cebadores degenerados 4. ¿Qué son los cebadores degenerados? ¿Cuáles son los principios o principios de diseño de los cebadores degenerados? ¿Cuáles son las diferencias entre los cebadores específicos y los cebadores 16s? ¿Puedes ver las bandas mirando sus productos de PCR?

1. El esquema de diseño de cebadores para el ácido nucleico de cebadores degenerados no está completamente claro, como TGGC(x)AAT, entonces al diseñar las posiciones de los cebadores (X) se pueden usar cuatro cebadores ATCG respectivamente

Cebadores específicos: No es necesario decir esto, que son cebadores ordinarios que usted diseña de acuerdo con el contexto después de que la secuencia es clara. Cebadores 16s: a menudo se usan para la identificación, los cebadores generales se pueden encontrar en la literatura y en sitios web El gen 16S rDNA correspondiente. El ARNr 16S está en bacterias. Hay cebadores degenerados altamente conservados en el genoma para la misma bacteria, la homología del genoma del ADNr 16S debe ser superior al 70%. Para el ADNr 16S, si hay una diferencia de más de 3 bases. Se puede concluir que las bacterias no pertenecen a la misma especie.

2. Los productos de la PCR salen comparando el tamaño de las bandas. Se utiliza comúnmente 16S rDNA de alrededor de 150 pb, sino cebadores degenerados y cebadores específicos. Depende de la situación específica. Si los cebadores están diseñados. Los intervalos son muy diferentes y se pueden separar. Dígame cómo calcular el valor de TM de los cebadores degenerados.

Tm (temperatura de fusión) se refiere a la temperatura cuando. El 50% de las dobles hebras se desenredan en hebras simples. Oligonucleótidos La concentración de ácido y la concentración de sal afectarán el tamaño del valor de Tm.

Hay muchas formas de calcular el valor de Tm. Usamos el método del vecino más cercano. (PN A S8 3, 3 7 4 6- 5 0) para calcular Utilice este método Antes del cálculo, hay muchas formas de estimar. Si es menor que 15 bases, entonces hay una buena manera de estimar. T, puedes multiplicar por 2_, para C y G, puedes multiplicar por 4_ y luego la Suma, esto se llama ley de Wallace

Tm= 2℃ (A + T) + 4℃ (G +. C)

Otra forma de estimar el contenido de GC en cadenas largas

Tm = 81,5 + 0,41(%GC) - 500/L + 16,6 log[M]

(L: longitud del oligonucleótido; M: concentración del catión monovalente)

Sin embargo, estos métodos no pueden eliminar la influencia del apilamiento de bases y los resultados no son precisos, por lo que se utiliza ampliamente el método del vecino más cercano. Sin embargo, para la determinación de oligonucleótidos por debajo de 60-70 pb o 15 pb, el método del vecino más cercano todavía tiene deficiencias.

El método del vecino más cercano utilizado por Bioneer tiene nuevas características. diferentes secuencias de bases durante el proceso de recocido, y lo determina a través de la termodinámica, que puede ser más efectiva. Por ejemplo, las secuencias de 5'-GC-3' y 5'-CG-3' son diferentes cuando se miden usando el. método termodinámico. Vea la captura de pantalla para ver el método de cálculo:

Basándose en el método termodinámico, la entalpía y la entropía pasan. Se determinan dos bases [sal] se refiere a la concentración de cationes monovalentes, [Oligo] se refiere a la. concentración de oligonucleótido durante la reacción. R se refiere a la constante del gas (1,987 cal_K-1mol-1). Bioneer utiliza el vecino más cercano. Al calcular el valor de Tm utilizando el método, se utiliza una concentración de sal de 50 mM y una concentración de oligonucleótido de 1 nM.

Bioneer proporcionará a cada usuario un valor de Tm, pero esto es solo una estimación y no podemos garantizar la precisión, este valor es solo para referencia del usuario.

Si no se amplifica ningún producto , puede reducir la temperatura de recocido a 4 a 5_ por debajo del valor de Tm. Si hay muchos productos no específicos, necesita cambiar las condiciones experimentales, como aumentar la temperatura de recocido, para obtener el producto correcto. Cómo usar Primer5.0 para. diseñar cebadores degenerados

Open primer premier 5.0——Archivo——Nuevo——Secuencia de ADN——COPIAR secuencia específica en GeneTank ——Primer——Buscar——Primeros PCR cebadores degenerados, Pares——

Establezca el rango de cebador sentido y antisentido y el rango de tamaño del producto de PCR - establezca la longitud del cebador (longitud del cebador) - Automático - Aceptar - haga clic en Aceptar después de completar la búsqueda - seleccione el par de cebadores en los resultados de la búsqueda. - Cambie los parámetros del cebador degenerado y busque nuevamente - encuentre el cebador más adecuado ¿Qué es el cebador degenerado? ¿Cuáles son los principios o principios de diseño?

Utilice NCBI para buscar la proteína o el ADNc codificado por la secuencia de aminoácidos del gen del mismo orden cebador degenerado en diferentes especies. Debido a la relación entre codones, degenera. Los cebadores son diferentes, lo que significa que representan una única codificación. Una mezcla de diferentes secuencias de todas las diferentes posibilidades de bases de un aminoácido. Los codones son degenerados. Los cebadores degenerados solo pueden predecir la secuencia de ADN codificada basándose en la secuencia de aminoácidos. Los cebadores degenerados son inexactos, pero pueden diseñarse como pares de cebadores degenerados para amplificar todas las secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias conocidas. Cuando se utilizan cebadores degenerados, la secuencia de nucleótidos en el oligonucleótido se puede cambiar, pero el número de nucleótidos debe ser el mismo. La secuencia de nucleótidos puede expresar la misma secuencia de aminoácidos, por lo que la secuencia de aminoácidos está realmente conservada