¿Cuáles son los métodos para construir transfectantes de células estables? ¿Cuál es el proceso para construir líneas celulares estables?
En el campo de las ciencias de la vida, la construcción de líneas celulares estables es una de las tecnologías más importantes. Una línea celular estable es una línea celular modificada con patrones y funciones de expresión genética específicos y, por tanto, tiene muchas perspectivas de aplicación, como el estudio de la función genética y la producción de proteínas. Este artículo presentará los métodos y procesos para la construcción de transfectantes de células estables.
Hay dos formas principales de construir líneas celulares estables: una es utilizar la administración de genes mediada por un vector viral y la otra es utilizar la transfección de plásmidos. El uso de la administración de genes mediada por virus a menudo resulta en la muerte o transformación celular, por lo que no es adecuado para aplicaciones que requieren la formación de proteínas expresadas de manera estable. Por lo tanto, este artículo se centrará en el método de construcción de cepas de transfección de células estables mediante transfección de plásmidos.
1. Seleccione una línea celular adecuada
Antes de comenzar a construir una línea celular estable, debe seleccionar una línea celular adecuada. En términos generales, las líneas celulares comúnmente utilizadas incluyen 293, HeLa y CHO. Al seleccionar una línea celular, se deben tener en cuenta factores como la facilidad de cultivo y transfección. Además, se requiere coordinación con otros proyectos de investigación en el laboratorio para garantizar que las líneas celulares seleccionadas sean adecuadas para el plan de investigación.
2. Seleccionar el vector plasmídico adecuado
La secuencia del plásmido es la base para construir cepas de transfección celular estables. En términos generales, al seleccionar un vector plasmídico, se deben considerar los siguientes factores:
(1) Seleccionar un plásmido con un gen marcador seleccionable apropiado para detectar células transfectadas de manera estable.
(2) Seleccionar un plásmido con un promotor de expresión de alta eficiencia para garantizar la eficiencia de la transcripción.
(3) Seleccione un plásmido con la secuencia de señal polimérica (PolyA) correcta para garantizar el procesamiento final de la transcripción correcto.
A la hora de seleccionar un plásmido, también hay que prestar atención a su facilidad de preparación y purificación para garantizar que la línea celular estable construida sea de alta calidad.
3. Transfección de plásmidos
La transfección de plásmidos es un paso clave en la construcción de líneas celulares estables, lo que también es una de las ventajas de esta tecnología. La transfección de plásmidos se puede lograr mediante una variedad de métodos, como la electroporación, la transfección con fosfato de calcio o el uso de agentes reticulantes. Para experimentos a pequeña escala, la transfección utilizando reactivos de transfección comerciales también es un método conveniente y rápido.
4. Cribado y expansión de células
Una vez completada la transfección, es necesario realizar un cribado de células que expresen de forma estable el gen deseado tras la transfección. A menudo se utilizan métodos de detección específicos, como antibióticos específicos, para detectar células con un gen marcador seleccionable para garantizar que solo las células transfectadas de manera estable sobrevivan y se expandan.
5. Verificar la estabilidad y la expresión de las células
Una vez completados el cribado y la expansión de las células, es necesario verificar la estabilidad y la expresión de las células construidas. Esto se puede lograr mediante una variedad de métodos, como tinción fluorescente, transferencia Western, etc. A través de estos métodos, es posible determinar qué células tienen una expresión genética estable y seleccionar estas líneas celulares estables para aplicaciones de investigación posteriores.
En resumen, la construcción de cepas de transfección celular estables es una tecnología difícil pero muy importante y tiene amplias perspectivas de aplicación en los campos de la investigación de la función genética y la producción de proteínas. El método anterior proporciona los principales pasos y procesos para construir líneas celulares estables y espera ser útil para los investigadores relevantes.