Proceso de preparación del dermatán sulfato

El DS se puede extraer mediante el método de sal neutra, método ácido, método alcalino, método de hidrólisis enzimática, etc. En la actualidad, se utiliza principalmente el método de combinación de extracción alcalina y extracción enzimática.

Gao Hua et al. aumentaron la concentración de álcali en el método de extracción por hidrólisis álcali-enzimática y utilizaron una solución de hidróxido de sodio de 1 mol/L para extraer durante 2 horas. Esto acortó el tiempo y evitó la precipitación de impurezas. El rendimiento de DS fue el mismo. La pureza alcanzó 32,6 y 95,2 respectivamente.

Xu Chuan et al. utilizaron hidrólisis enzimática de cartílago de tortuga de caparazón blando para extraer DS antes de hidrolizarlo con 2-acetato de sodio. El contenido de nitrógeno del producto se pudo reducir en un 0,67%, mientras que la masa de hexosamina. La fracción aumentó un 1,87%, lo que tiene cierto valor de producción industrial.

Li Ruiguo llevó a cabo cuatro procesos de extracción: hidrólisis álcali-enzimática concentrada (I), hidrólisis álcali-enzimática diluida (II), hidrólisis enzimática álcali diluida y sal diluida (III), y álcali diluido y sal concentrada. (IV) Después de la comparación, se encontró que el tiempo de extracción del proceso I es corto, el producto es de color oscuro y el peso molecular es pequeño. Los procesos II, III y IV son más fáciles de operar, el color del producto es bueno y; el peso molecular es mayor, especialmente el producto producido por el proceso IV es de mejor calidad.

Hua Ziyi adopta el método de hidrólisis enzimática doble de enzima compuesta alcalina y tripsina para extraer CS. El rendimiento es 1-2 mayor que el método tradicional, el ciclo de producción se acorta en 1/3 y el costo de producción es. reducido en 5.

Nakano et al. utilizaron 0,1 mol/l de acetato de sodio para pretratar el cartílago nasal bovino a pH 4,5 y 37 °C, de modo que el tejido del cartílago se descompusiera automáticamente bajo la acción de enzimas endógenas, eliminando la necesidad de utilice enzimas exógenas. El costo de producción se reduce y la mezcla de GAG ​​que contiene DS 89 se puede obtener mediante purificación por cromatografía de intercambio iónico DEAE. Las diferentes solubilidades y densidades de carga de varios GAG se pueden utilizar para fraccionar y purificar CS. Los métodos de separación comúnmente utilizados incluyen precipitación con etanol, precipitación con solución salina, complejación con sales cuaternarias y cromatografía de intercambio iónico, entre los cuales la precipitación con etanol es el más utilizado.

Gao Hua et al. utilizaron un proceso de concentrar primero el hidrolizado enzimático a baja temperatura y presión reducida y luego precipitarlo con etanol, lo que puede reducir la cantidad de etanol y aumentar el rendimiento del producto al mismo tiempo. .

Cuando Zhang Zheng et al. separaron y purificaron DS, primero usaron filtración en gel Sephadex G-10 y luego usaron resina de intercambio iónico macroporosa D061 para la cromatografía de intercambio iónico. La pureza se pudo aumentar a 99,7. En los últimos años, la tecnología de membranas también se ha utilizado para la separación y purificación de CS.

Lignot et al. han confirmado la viabilidad de la tecnología de ultrafiltración para concentrar y purificar DS a través de estudios comparativos, y han demostrado que la membrana de ultrafiltración con un tamaño de poro de 0,1 µm tiene el mejor efecto de separación. Existen muchos métodos de análisis para DS. En general, existen métodos de cromatografía líquida de alta resolución, espectrofotometría, electroforesis y análisis estructural.

1. Cromatografía líquida de alta resolución

Algunos de los compuestos de glucosaminoglucanos contienen grupos éster de sulfato, otros no contienen grupos éster de sulfato y los que contienen grupos éster de sulfato contienen muchos grupos éster de sulfato. Cada isómero contiene una gran cantidad de otros componentes en la base lipídica DS, por lo que a menudo es necesario separarlos antes de la medición.

La estructura de la unidad de disacárido DS contiene grupos éster de sulfonato y grupos de ácido carboxílico extremadamente fuertes. Es soluble en agua y tiene un gran peso molecular. La cromatografía líquida de alto rendimiento se utiliza principalmente para separar y detectar diferentes componentes.

La detección ultravioleta de glucosaminoglicanos tras hidrólisis y separación mediante cromatografía líquida de alta resolución tiene una trayectoria de más de 20 años, y la investigación en este campo también ha avanzado mucho en los últimos años. Los métodos de análisis específicos son:

(1) Método de identificación por fluorescencia de hidrólisis de proteasa-endo-β-xilosidasa;

(2) Método de quimioluminiscencia;

(3 ) Método de determinación de separación directa;

(4) Cromatografía de iones de nitrificación, etc.

2. Espectrofotometría

El DS se disuelve en agua y se convierte en un líquido viscoso, incoloro y transparente con un pico de absorción en la región ultravioleta de 180-200 nm. Hay demasiadas sustancias perturbadoras con absorción en este rango de longitud de onda. Si las sustancias existentes no se separan, la medición no tiene significado real.

El contenido de CS se puede medir en la región de luz visible utilizando la reacción de color entre el grupo éster de sulfato reactivo y el grupo acetilamino en la unidad estructural del disacárido y varios reactivos cromogénicos.

Se puede dividir en dos situaciones:

(1) el DS reacciona con el cromógeno para desarrollar color sin hidrólisis. Los métodos incluyen el método del derivado de tiazol, el método Bidukeng, etc.

(. 2) Después de la hidrólisis, reacciona con un agente cromogénico para desarrollar color. Los métodos incluyen el método de acetilacetona-p-dimetilaminobenzaldehído, el método de floroglucinol, el método de azul de metileno, etc.

3. Método de electroforesis

El método de electroforesis tiene una preparación de muestra simple, una dosis pequeña y un tiempo de análisis corto, y se puede aplicar al análisis cuantitativo de DS.

En comparación con los métodos tradicionales, este método no requiere un pretratamiento complejo de la muestra y el tiempo de análisis se reduce considerablemente.

4. Métodos de análisis estructural

Los métodos utilizados actualmente para el análisis de estructura DS incluyen principalmente IR, UV, HPLC, CE, MS, NMR, etc.