Discusión sobre tecnología celular: experiencia de eliminación genética de RAW264.7
La célula de leucemia de macrófagos monocitos de ratón RAW264.7 se usa ampliamente en la investigación de inflamación, inmunidad, apoptosis y tumores. Debido a que RAW264.7 puede realizar pinocitosis y fagocitosis, es considerada una de las más utilizadas. los mejores modelos de macrófagos.
Cómo resolver la desactivación genética de las células RAW264.7 también es una importante dirección de investigación y desarrollo de Haixing Bio-cas9x.com. Después de más de un año de investigación y desarrollo, finalmente resolvimos este problema de RAW264. 7. Para el problema de la edición de genes en líneas celulares, podemos ofrecer a los clientes soluciones para la eliminación de genes celulares con alta eficiencia de edición, resultados estables y tiempos de ciclo rápidos.
El proceso técnico de eliminación de genes/activación de genes/mutación de genes en células RAW264.7 es el siguiente:
1. Condiciones de cultivo y precauciones de células RAW264.7
Las condiciones de cultivo utilizadas para las células RAW264.7 son: DMEM alto contenido de glucosa 10FBS. Las células RAW264.7 tienen requisitos relativamente altos de calidad del suero y se recomienda utilizar suero bovino fetal de alta calidad.
Las células RAW264.7 tienen dos estados:
1. Células RAW264.7 no activadas: generalmente de forma redonda y de débil adhesión.
2. RAW264 activada; .7 células: una vez estimuladas, las células RAW264.7 activadas desarrollarán pseudópodos y mejorarán su capacidad de adhesión. Al mismo tiempo, también aumentará la expresión del marcador activado en la superficie celular.
Por lo tanto, durante el proceso de cultivo de las células RAW264.7, se debe cambiar el medio y pasarlo a tiempo, de lo contrario, el estado de las células hambrientas se deteriorará drásticamente y aparecerá una gran cantidad de pseudópodos, que aparecerán. es irreversible. Finalmente, la tasa de crecimiento celular disminuirá y se volverá muy lenta.
Fotos del cultivo celular RAW264.7 en la web oficial de la ATCC
Porque tenemos un mejor control sobre la frecuencia de paso y reemplazo del medio de las células RAW264.7, el estado de RAW264. 7 celdas se han mejorado mucho. La siguiente imagen es una imagen del estado de la celda de RAW264.7.
Fotos del cultivo celular RAW264.7
2. Optimización de las condiciones de transfección de las células RAW264.7
Starfish Bio-cas9x.com realizará según las Características optimizar las condiciones de electroporación, incluida la optimización del tampón de electroporación. Intentamos agregar un adsorbente al tampón de electroporación, que puede promover en gran medida la adsorción de ADN a la superficie de las células y también aumentar la resistencia del tampón, proporcionando así. El voltaje de la transferencia eléctrica mejora en gran medida la eficiencia de la transferencia eléctrica. Es de 3 a 5 veces más eficiente que el sistema de amortiguación tradicional, alcanzando el 80%. Al mismo tiempo, debido a que la tasa de supervivencia de las células ha aumentado al 90%, la eficiencia de la edición de genes celulares también ha mejorado considerablemente.
Imágenes comparativas 72 horas después de la electroporación del vector de expresión GFP
3. Optimización de las condiciones de clonación rápida de células RAW264.7;
Debido al uso de ClonePlus tecnología, RAW264 La formación de clones celulares de .7 puede alcanzar más del 95%, y el tiempo de formación de clones también se reduce a 1-2 semanas, lo que acorta en gran medida todo el ciclo de tiempo de detección de clones. (El proceso de clonación tradicional dura 1 mes)
En comparación con el método viral, la tecnología VIRUS-Free es más eficiente, tiene un ciclo más corto y puede evitar el riesgo de replicación del virus. En comparación con las células adherentes, las células en suspensión son más difíciles de detectar para detectar resistencia a los medicamentos y tienen una baja eficiencia de monoclonación. Además, la eficiencia de la mutación dirigida al sitio del gen es mucho menor que la eficiencia de la eliminación del gen. la falta de homocigotos mutantes obtenidos La probabilidad es extremadamente baja.
La tecnología ClonePlus utiliza un tratamiento de superficie coloidal patentado. La tasa de clonación de la línea celular RAW264.7 supera el 95. Puede realizar fácilmente el aislamiento de clones y la identificación por PCR de clones, lo que mejora en gran medida la tasa positiva de identificación celular.