¿Cuál es el proceso para construir líneas celulares estables?
La construcción de líneas celulares estables es una técnica experimental comúnmente utilizada para la expresión a largo plazo de proteínas específicas o para estudios funcionales. El siguiente es un proceso general de construcción de líneas celulares estables:
Construcción de líneas celulares transducidas de manera estable
Seleccione una línea celular huésped: seleccione una línea celular que pueda transportar genes extraños de manera estable como célula huésped . Las líneas celulares de uso común incluyen HEK293, CHO, HeLa, etc.
Construir un vector de expresión: Diseñar y construir un vector de expresión que contenga el gen diana. El vector normalmente incluye un promotor, un gen marcador seleccionable (tal como un gen de resistencia a antibióticos) y la secuencia codificante del gen diana.
Transfección: Transfectar el vector de expresión en células huésped. Se pueden utilizar una variedad de métodos de transfección, tales como métodos químicos, métodos de electroporación, transfección mediada por vectores virales, etc. Detección de selección: agregue la presión de selección correspondiente (como antibióticos) después de la transfección para descartar las células que han integrado con éxito el vector de expresión. Las células generalmente se diluyen adecuadamente para garantizar que cada unidad celular clonal pueda crecer adecuadamente.
Cribado de clones únicos: seleccione clones de células individuales de las células analizadas. Los clones individuales se pueden sedimentar en placas de 96 o 384 pocillos utilizando el método de dilución o el método de limitación de dilución.
Identificación: Examinar e identificar células monoclonales para confirmar si el gen diana se ha integrado con éxito. Los métodos de identificación más utilizados incluyen PCR, Western blot, microscopía de fluorescencia, etc.
Expansión y criopreservación: seleccione clones apropiados de las células monoclonales identificadas, realice la amplificación celular, guarde células de respaldo y congélelas para usarlas en experimentos posteriores.
Mantenimiento a largo plazo: paso regular y cultivo de líneas celulares estables para mantener su capacidad de expresar genes diana de manera estable. Paralelamente se realizará la verificación e identificación de líneas celulares estables cuando sea necesario.
En cada paso, se debe prestar atención a factores como las condiciones operativas, los medios de cultivo, las condiciones de cultivo y la seguridad del laboratorio para garantizar la construcción exitosa de líneas celulares estables. Los procedimientos y condiciones específicos pueden variar dependiendo de factores como el propósito experimental, la línea celular y el diseño del vector. Por lo tanto, antes de la implementación, es mejor consultar la literatura y la experiencia relevantes y optimizar y ajustar de acuerdo con la situación real.