Sonda de baja fototoxicidad “ilumina” las mitocondrias
Recientemente, el resultado de una investigación publicado en línea en "Chemical Science" mostró que investigadores de la Universidad de Pekín y la Universidad de West Lake desarrollaron conjuntamente dos nuevos tipos de sondas, PK Mito Red (PKMR) y PK. Mito Crimson (PKMDR), redujo significativamente la fototoxicidad a nivel de células vivas por primera vez.
El siglo XXI se considera la era de las ciencias de la vida. Para descubrir aún más los misterios de los procesos biológicos celulares, los científicos han desarrollado varias tecnologías de imágenes biológicas. Entre ellos, las imágenes de superresolución de fluorescencia se destacan por sus condiciones de imagen simples y su compatibilidad con muestras biológicas.
Superando el problema del "cuello atascado" en las imágenes de superresolución
Ya en 2065438+2008, el SIM de Hesse desarrollado por Chen et al en el Instituto de Medicina Molecular de. La Universidad de Pekín reveló por primera vez la actividad de la delicada estructura de las crestas internas de las mitocondrias intracelulares y sus cambios dinámicos.
Para satisfacer las necesidades de los nuevos microscopios ópticos, muchos equipos de investigación científica nacionales y extranjeros han desarrollado una variedad de nuevas sondas mitocondriales fotoestables para observar la estructura de las crestas internas mitocondriales.
Sin embargo, la alta intensidad de excitación requerida para obtener imágenes de súper resolución a menudo hace que las sondas fluorescentes mitocondriales tengan más probabilidades de generar especies reactivas de oxígeno (ROS), que no desaparecen a medida que aumenta el tiempo de muestreo.
Estas imágenes de superresolución, incluso si la sonda fluorescente en sí no está completamente blanqueada, destruirán rápidamente las crestas internas de las mitocondrias, lo que hará que las mitocondrias se hinchen y se vuelvan redondas.
“Aunque la fototoxicidad no tiene ningún efecto sobre la resolución óptica, tendrá un gran impacto en la estructura celular, y las células se dañarán o incluso morirán. En este caso, lo que ves y la respuesta fisiológica es completamente diferente ."
Chen Zhixing, uno de los autores correspondientes de este trabajo e investigador del Instituto de Medicina Molecular de la Universidad de Pekín, dijo a China Science News.
En otras palabras, el principal problema que debe resolverse en las imágenes de superresolución de células vivas es en realidad mejorar la fototoxicidad, no solo el fotoblanqueo.
En vista de los nuevos puntos débiles en este campo, el equipo de Chen Zhixing utilizó la estrategia de conjugación intramolecular del ciclooctatetraeno para sintetizar con éxito dos nuevas sondas fluorescentes mitocondriales poco fototóxicas: PKMR y PKMDR, que se utilizaron in vivo para por primera vez se logró una reducción significativa de la fototoxicidad a nivel celular.
Además, el equipo también cooperó con Chen, el equipo y el equipo de la Universidad de West Lake. Experimentos adicionales han demostrado que este nuevo tinte es significativamente menos fototóxico para las células que la serie de tintes MitoTracker disponible comercialmente y puede lograr imágenes de súper resolución de más de 1.000 cuadros con la forma básicamente sin cambios de las crestas mitocondriales internas. Se demostró por primera vez que esta sonda se puede utilizar para la clasificación del flujo de células madre planarias sin afectar la pluripotencia de las células madre, y se puede utilizar realmente para estudiar la función mitocondrial en procesos fisiológicos como la reprogramación de células madre.
La fototoxicidad baja es más leve
Según Chen Zhixing, la fototoxicidad de las sondas fluorescentes generalmente proviene del primer estado excitado generado por el primer estado singlete excitado (S1) durante el proceso de excitación Triplete. En el estado (T1), T1 interactúa con el oxígeno para generar oxígeno singlete y otras especies reactivas de oxígeno, destruyendo así las biomoléculas.
Para suprimir este proceso al máximo y reducir la fototoxicidad, el equipo adoptó la estrategia de extintores tripletes conjugados intramoleculares (colorantes autocurativos), que se ha aplicado previamente a láseres de tinte, áreas como Imágenes de una sola molécula para reducir el fotoblanqueo.
Los experimentos de fotosupervivencia en células HeLa muestran que solo el ciclooctatetraeno (COT) puede reducir eficazmente la fototoxicidad en imágenes de fluorescencia.
Más importante aún, el equipo también observó que los grupos que reducen el fotoblanqueo (nitrobenceno) no necesariamente reducen la fototoxicidad.
Debido a esto, "la fototoxicidad y las propiedades de fotoblanqueo de las sondas fluorescentes deben probarse por separado, pero en diseños de sondas fluorescentes anteriores, a menudo se ignoraba la caracterización detallada de la fototoxicidad de las sondas y otras propiedades", explicó Chen Zhihang.
Sobre esta base, el equipo utilizó COT como grupo de extinción del triplete y sintetizó dos sondas fluorescentes, PKMR y PKMDR, con cianina como núcleo.
Experimentos de fotosupervivencia en células HeLa muestran que la fototoxicidad de la nueva sonda no es tan alta como 1/5 de la sonda comercial (MitoTrackers) con el espectro correspondiente, y puede proporcionar el mismo brillo o incluso mayor. bajo las mismas condiciones.
“Se puede decir que este trabajo ha encontrado una nueva dirección para el campo y se espera que reduzca la fototoxicidad de la sonda a un nivel más bajo o incluso la elimine por completo en el futuro”. dicho.
Innovación colaborativa al extremo
2065438+En junio de 2008, Chen Zhixing se unió al Instituto de Medicina Molecular de la Universidad de Pekín después de regresar a China.
En ese momento, el SIM de Hesse desarrollado por el equipo de Chen no solo mejoró el rendimiento de la microscopía óptica a un nuevo nivel, sino que también mejoró en gran medida la fototoxicidad de la tecnología de imágenes de súper resolución desde aspectos matemáticos y físicos.
Para lograr lo último en tecnología de imágenes de súper resolución, se debe llevar a cabo innovación colaborativa en la dirección de sondas químicas.
La incorporación de Chen Zhihang, que tiene experiencia en investigación química, sin duda ha inyectado un fuerte impulso al equipo.
Desde junio de 2065438 hasta junio de 2008, se lograron importantes avances en la investigación de sondas. Al equipo solo le llevó más de un año, pero repitió tres generaciones de diseños y finalmente encontró una solución eficaz.
Después de probar la aplicación de nuevas sondas en el campo de la clasificación de células madre, el equipo de Lei Kai, que lleva mucho tiempo involucrado en la investigación sobre la regeneración de células madre, descubrió que las mitocondrias marcadas con la nueva sonda pueden ayudar a clasificar las células madre. Usando la nueva sonda, las células madre marcadas aún pueden mantener una buena viabilidad y sequedad in vitro, demostrando plenamente su excelente biocompatibilidad en la clasificación por análisis de fluorescencia de flujo.
Más importante aún, la nueva sonda también muestra excelentes ventajas en imágenes de súper resolución de largo alcance.
Los resultados de las imágenes de Hessian SIM muestran que la nueva sonda proporciona una resolución cercana al valor teórico del Hessian SIM 2D, mostrando una imagen clara de la estructura de las crestas mitocondriales conservando al mismo tiempo la forma original de las mitocondrias. mayor medida.
Las mitocondrias marcadas con el tinte comercial MitoTracker Red CMXRos (MTR) están obviamente hinchadas y deformadas alrededor de los 140 fotogramas, y las estructuras fisiológicas normales como las crestas no se pueden ver por encima de los 200 fotogramas, mientras que las mitocondrias marcadas con PKMR puede proporcionar mejores resultados en más de 1000 fotogramas. Para imágenes mitocondriales sanas, el grado de deformación mitocondrial en alrededor de 2000 fotogramas es aún menor que el de las sondas comerciales en 200 fotogramas.
“En el siguiente paso, continuaremos trabajando juntos en matemáticas, física y química para llevar la tecnología al extremo. Al mismo tiempo, nos esforzaremos por lograr una transformación en el futuro para romper el monopolio de la tecnología. empresas extranjeras en la dirección de instrumentos/sondas de imágenes de alta gama y realmente proporcionar a los investigadores biomédicos herramientas nacionales de imágenes de alta gama que superen los productos extranjeros", dijo Chen Zhixing.
Información del artículo relacionado:
https://doi.org/10.1039/D0SC02837A
"China Science News" (tercera edición, 7 de septiembre de 2020)