Ciencia| Científicos descubren un nuevo objetivo que puede evitar que la enfermedad de Parkinson empeore

La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común después de la enfermedad de Alzheimer (EA). Es más común en personas de mediana edad y personas mayores. Los principales síntomas de los pacientes son: Incluye síntomas motores. como temblor, lentitud de movimientos y miotonía y una serie de síntomas no motores. Sus opciones de tratamiento actuales solo pueden aliviar los síntomas del paciente pero no pueden prevenir la progresión de la EP. Es una enfermedad progresiva, por lo que es muy importante encontrar una opción de tratamiento que pueda prevenir la progresión de la EP.

El 2 de noviembre de 2018, el equipo de Valina L. Dawson y Ted M. Dawson del Centro de Enfermedades Neurodegenerativas e Investigación de Células Madre de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins publicó un artículo titulado Poly(ADP - ribosa) impulsa la neurodegeneración patológica de la α-sinucleína en la enfermedad de Parkinson, y descubrió que la poli(ADP-ribosa) puede mejorar la toxicidad de la α-sinucleína, promover la agregación de la α-sinucleína y participar en el daño celular patológico mediado por la α-sinucleína, promoviendo la progresión de la EP. Este descubrimiento puede proporcionar un objetivo terapéutico para prevenir la progresión de la EP [1]. La revista Science también publicó un artículo de revisión sobre el resultado de esta investigación [2].

¿Alguna de las moléculas te resulta familiar? Por cierto, la poli(ADP-ribosa) es PAR, que también se mencionó en el artículo anterior.

Ahora estudiemos este artículo juntos.

La enfermedad de Parkinson y la alfa-sinucleína

La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa progresiva. Los pacientes se presentan principalmente con temblor en reposo, lentitud de movimientos y debilidad muscular. Los cuatro síntomas motores principales son rigidez y. trastorno postural de la marcha, y algunos se acompañan de síntomas no motores como ansiedad, depresión, trastornos del sueño, disfunción del sistema nervioso autónomo y deterioro cognitivo.

El principal cambio patológico de la enfermedad de Parkinson es la disminución de las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia negra del mesencéfalo, y la presencia de cuerpos de inclusión eosinófilos, concretamente cuerpos de Lewy, en el citoplasma del resto de neuronas. . La α-sinucleína similar a una fibra (α-syn) es el componente principal de los cuerpos de Lewy.

La α-syn es una proteína presináptica ampliamente expresada en el cerebro. Se encuentra en forma de monómeros proteicos solubles en condiciones fisiológicas. Cuando se agrega en oligómeros fibrilares insolubles, es patógeno y puede provocar la muerte de las células neuronales. . El α-syn patológico puede propagarse entre células como priones y promover la progresión de la EP.

Pero ¿qué causa la agregación patológica de α-syn? ¿Cómo causa la muerte celular el α-syn agregado patológicamente? Nada de esto está claro todavía.

PAR y PARP1

La Poli(ADP-ribosa) (PAR) es un producto sintetizado por la Poli(ADP-ribosa)polimerasa-1 (PARP-1) utilizando NAD+ como sustrato. . La función principal de PARP-1 y PAR en el núcleo celular es detectar daños en el ADN causados ​​por diversas causas e iniciar el correspondiente mecanismo de reparación del ADN.

Muerte celular dependiente de PARP-1

La muerte celular dependiente de PARP-1 (Parthanatos) es una forma de necrosis celular programada causada por la activación de PARP-1. Lleva el nombre de “par” (el producto enzimático de PARP-1) + “thanatos” (el dios griego de la muerte).

Parthanatos, una forma de muerte celular, se encuentra ampliamente en enfermedades neurológicas, cardíacas y otras enfermedades.

Dado que PARP-1 y PAR en Parthanatos pueden provocar la muerte celular, el autor pretende explorar si PARP-1 y PAR están implicados en la pérdida patológica de neuronas DA inducida por α-syn en la EP.

1? La neurotoxicidad de α-syn?PFF depende de PARP-1

Las fibrillas preformadas de α-syn (α-syn PFF) son un agregado recombinante de α-syn in vitro en fibras como α-syn en el cuerpo y puede propagarse entre células neuronales como un prión. Cuando se inyecta en el cerebro de ratones, su sitio S129 puede fosforilarse, formando p-α-syn (un sello distintivo de α-syn patológico). syn), y por lo tanto es un buen modelo para estudiar α-syn.

Para explorar si α-syn PFF puede activar PARP-1, el autor utilizó α-syn PFF para tratar células neuronales corticales primarias de ratón, detectó los cambios en PAR mediante WB y encontró la expresión de PAR en los días 3-7. Aumente gradualmente hasta el pico más alto y mantenga el estado creciente hasta el día 14.

La tinción con PI encontró que el aumento de PAR iba acompañado de un aumento de la muerte celular.

Se descubrió que el tratamiento de las células con tres inhibidores de PARP (ABT-888, AG-014699, BMN 673) previene la activación de PARP y la muerte celular inducida por α-syn PFF.

Las células tratadas con α-syn PFF pueden promover la fosforilación de α-syn en el sitio S129 para formar p-α-syn y promover la formación de α-syn insoluble a partir de α-syn soluble en agua. , los cuales son patológicos Caracterización de α-syn sexual. Los inhibidores de PARP pueden prevenir significativamente estos efectos.

Derribar o eliminar PARP-1 también puede prevenir significativamente la activación de PARP y la apoptosis celular inducida por α-syn PFF.

La eliminación de PARP-1 puede prevenir la fosforilación de α-syn inducida por PFF de α-syn y la formación de α-syn insoluble.

El inhibidor de caspasas de amplio espectro Z-VAD puede reducir parcialmente la toxicidad de α-syn PFF, mientras que el inhibidor de necroptosis Nec-1 y el inhibidor de autofagia 3-MA no pueden reducir la muerte celular inducida por α-syn PFF , el inhibidor de PARP ABT-888 puede prevenir la muerte celular inducida por α-syn PFF, lo que indica que la muerte celular inducida por α-syn PFF depende principalmente de PARP-1, es decir, parthanatos, en lugar de mediante la activación de la apoptosis, necrosis. o autofagia.

Los resultados experimentales anteriores muestran que eliminar PARP-1 o inhibir PARP-1 con fármacos puede reducir la formación de p-α-syn. ¿Podría esta reducción deberse a la reducción de α-syn PFF endocitosado? ¿por células?

El autor enriqueció los endosomas celulares y detectó el contenido de α-syn PFF marcado con biotina en los endocitosomas en condiciones de eliminación de PARP-1 e inhibición del fármaco. Descubrieron que no había diferencias significativas con respecto al grupo de control, lo que indica. que PARP-1 no afecta la absorción de α-syn PFF por parte de las células.

Se mencionó en la introducción de antecedentes que α-syn PFF puede propagarse entre células como un prión y promover la progresión de la EP. ¿Su propagación de célula a célula también depende de PARP-1?

El autor realizó un experimento en cámara de microfluidos, primero, se añadió α-syn PFF a la cámara 1 (C1) a través del dispositivo de microfluidos, y luego, el día 14, ya sea en la cámara 2 (C2) o en la cámara. 3 (C3) fue probado. Aparece α-syn, es decir, si α-syn PFF tiene una función de propagación.

Los resultados mostraron que p-α-syn podía detectarse en C2 y C3 el día 14 en el grupo de neuronas WT, mientras que era básicamente indetectable en el grupo PARP-1 KO, lo que indica que la función de propagación de α-syn PFF también es limitado.

2? α-syn PFF activa PARP-1 a través del daño en el ADN inducido por NO

La primera parte ha demostrado que α-syn PFF puede activar PARP -1, y ejerce sus efectos neurotóxicos a través de PARP-1, entonces, ¿cómo activa α-syn PFF PARP-1?

Los autores descubrieron que tratar células neuronales con α-syn PFF o inyectarlas directamente en el cerebro de ratones puede provocar un aumento de los niveles de NO en las células y un mayor daño en el ADN.

El tratamiento de células neuronales o de cerebro de ratón con el inhibidor de la NO sintasa L-NAME puede inhibir la síntesis de NO inducida por α-syn PFF, el daño al ADN y la activación de PARP-1.

Además, los inhibidores de la NO sintasa también pueden inhibir la muerte celular inducida por α-syn PFF.

La descripción anterior muestra que α-syn PFF causa daño en el ADN al activar la NO sintasa, activa PARP-1 y provoca la muerte celular a través de parthanatos.

3?α-syn?PFF media la pérdida de neuronas DA a través de PAR

Se ha demostrado previamente que α-syn PFF causa la muerte celular a través de parthanatos, entonces, ¿seguirá esta vía? ¿Está relacionado con la pérdida de neuronas DA en la EP?

Inyectar α-syn PFF en el cuerpo estriado de un lado de los ratones puede activar PARP-1 y aumentar los niveles de PAR, mientras que eliminar PARP-1 o tratar con un inhibidor de PARP-1 puede prevenir α-syn PFF El aumento inducido por -syn PFF en los niveles de PAR alivia la neurotoxicidad de α-syn PFF.

Al mismo tiempo, 6 meses después de la inyección de α-syn PFF, el número de neuronas DA en el lado de la inyección de los ratones WT disminuyó aproximadamente un 50%, mientras que el número de neuronas DA en el lado de la inyección PARP- 1 grupo knockout y el grupo de tratamiento con inhibidor de PARP-1 no hubo una disminución significativa en las neuronas DA.

La tirosina hidroxilasa (TH) es una enzima clave para la síntesis de DA. El autor descubrió que después de tratar ratones WT con α-syn PFF, TH y transportador de dopamina (DAT), los niveles se redujeron significativamente y se eliminaron. o inhibir PARP-1 podría prevenir este fenómeno.

Además, los contenidos de DA y metabolitos de DA en el cuerpo estriado de ratones WT tratados con α-syn PFF se redujeron significativamente, mientras que no hubo cambios significativos en el grupo PARP-1 KO y el grupo PARP- 1 grupo tratado con inhibidores.

La inyección de α-syn PFF en el cerebro de ratones WT puede hacer que los ratones prolonguen la prueba de poste (prueba de poste), reduzcan la fuerza de la prueba de fuerza de agarre (fuerza de agarre) y eliminen PARP- 1 o PARP-1 El tratamiento con agentes inhibidores puede aliviar los síntomas motores de la EP causados ​​por α-syn PFF.

4? PAR promueve la fibrosis α-syn

Estudios anteriores han demostrado que PAR puede causar la estratificación de líquidos proteicos intrínsecamente desordenados y provocar su agregación. Entonces, ¿puede PAR promover la agregación α-syn? ?Paño de lana?

Con o sin PAR, el autor observó la formación de polímeros después de incubar el monómero α-syn durante un período de tiempo, y descubrió que cuando no se agregaba PAR, la diferencia no aparecía hasta las 72 horas de incubación de monómero α-syn con diferentes pesos moleculares, pero con la adición de PAR, aparecieron polímeros α-syn con diferentes pesos moleculares en 24 horas.

Diferentes temperaturas de incubación o diferentes concentraciones de PAR pueden causar diferencias en la eficiencia de la fibrilación α-syn (Fig. S7A-C original).

El colorante fluorescente fluorescente tioflavina T (ThT) se puede utilizar para el seguimiento cualitativo y cuantitativo del proceso de agregación de fibrillas de amiloide. A través del monitoreo de fluorescencia ThT, se puede ver que PAR puede promover significativamente la agregación α-syn.

La microscopía electrónica de transmisión mostró que cuando los monómeros α-syn se incubaban durante 72 horas sin PAR, aparecían fibras de oligómero α-syn, mientras que con PAR, se podían ver oligómeros α-syn después de 12 horas.

Dado que PAR es una molécula altamente cargada negativamente, para descartar que la agregación α-syn causada por PAR se deba a interacciones de carga entre proteínas, el autor estudió el efecto de la molécula PolyA, igualmente cargada negativamente, sobre La agregación de α-syn encontró que no promovía significativamente la agregación de α-syn.

El ensayo de superposición muestra que existe una interacción entre PAR y α-syn, pero no hay interacción entre el monómero ADP ribosa (ADPr) y α-syn, y no afecta la agregación de α-syn .

PARP-1 puede promover la ribosilación de proteínas por ADP, entonces, ¿hará que α-syn se someta a ribosilación?

El ensayo de ribosilación in vitro (IVRA) muestra el no.

Tanto el ensayo de superposición como el Co-IP mostraron la interacción entre α-syn y PAR. El autor utilizó el análisis de eliminación y Co-IP para confirmar que α-syn interactúa con PAR a través de su extremo amino.

Para explorar si la producción endógena de PAR puede promover la agregación de α-syn, los autores utilizaron ácido N-metil-D-aspártico (NMDA) para tratar la corteza primaria del ratón que sobreexpresa α-syn en células neuronales. , se descubrió que NMDA puede activar PARP y hacer que α-syn se agregue. Sin embargo, después de que PARP-1 se elimina o se trata con un inhibidor de PARP-1, α-syn ya no se agrega.

La administración exógena de PAR en células PARP-1 WT y PARP-1 KO que sobreexpresan α-syn puede rescatar la agregación de α-syn.

En el neuroblastoma SH-SY5Y que sobreexpresa WT α-syn y α-syn A53T, la administración del activador de PARP MNNG puede promover la agregación de α-syn, la eliminación de PARP-1 o la administración del inhibidor de PARP After -1, La agregación de α-syn se reduce y la suplementación exógena de PAR también puede rescatar la reducción de la agregación de α-syn causada por la inhibición o eliminación de PARP-1.

5?PAR mejora la toxicidad in vitro de α-syn PFF

Previamente se demostró que PAR se une a α-syn PFF, por lo que esta combinación cambiará la biofísica de α- ¿Atributo sin PFF?

El autor utilizó proteinasa K (proteinasa K) para digerir las células tratadas con α-syn PFF y PAR-α-syn PFF, y descubrió que las células tratadas con PAR-α-syn PFF eran más resistentes. a la digestión de PK. Se sugiere que PAR-α-syn PFF se pueda plegar más estrechamente.

La primera parte ha demostrado que α-syn es neurotóxico. El autor repitió aproximadamente los experimentos de la primera parte, como que PAR promueve la muerte celular (Fig. S10 original), promoviendo la producción de p-α. -syn, y la promoción de α -syn insoluble genera y promueve la endocitosis y diseminación de α-syn (Fig. S11 original), lo que demuestra que PAR puede mejorar significativamente la toxicidad in vitro de α-syn.

6?PAR mejora la toxicidad in vivo de α-syn?PFF

Para explorar el efecto de PAR sobre la toxicidad in vivo de α-syn?PFF, los autores combinaron Se inyectó α-syn PFF o PAR–α-syn PFF en el cuerpo estriado de un lado de los ratones, y se descubrió que el grupo de inyección de PAR–α-syn PFF tenía una pérdida más temprana de neuronas DA, una formación más temprana de p-α- syn, y el nivel de p-α-syn fue significativamente mayor en el grupo de inyección de α-syn PFF.

Además, en comparación con α-syn PFF, PAR–α-syn PFF promovió significativamente la pérdida de DA y sus metabolitos (Fig. S13 original) y disminuyó los niveles de TH y DAT (Fig. S14 original). ), el rendimiento de los ratones en la prueba de escalada en poste y en la prueba de fuerza de agarre empeoró.

7? Aumento de los niveles de PAR en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con EP

Los autores detectaron niveles de PAR en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de dos cohortes independientes de pacientes con EP y controles, y encontraron que los niveles de PAR en el LCR de los pacientes con EP aumentaron significativamente y los niveles de PAR se correlacionaron positivamente con la duración de la enfermedad y el estadio de Hoehn y Yahr.

Además, los autores descubrieron que los niveles de PAR en la sustancia negra (SN) de pacientes con EP también aumentaban significativamente, lo que concuerda con resultados de investigaciones anteriores.

El α-syn patológico induce daño en el ADN al activar la NO sintasa y activa PARP-1. El PAR producido promueve la generación de α-syn patológico y provoca la muerte celular a través de parthanatos. Eliminar o reducir PARP-1 inhibe la toxicidad patológica de α-syn. PAR puede mejorar la toxicidad de la α-syn patológica in vivo e in vitro, formando un circuito de retroalimentación. El contenido de PAR en el líquido cefalorraquídeo y la materia negra en pacientes con EP aumenta significativamente. Lo anterior sugiere que la activación de PARP-1 está implicada en la progresión de la EP, por lo que se espera que inhibir la activación de PARP-1 prevenga la pérdida progresiva de neuronas DA en la EP.

Esta imagen es una ilustración de la historia completa.

La rutina de este artículo se muestra en la siguiente figura.

Espero que este artículo pueda inspirarte.

Referencias

[1]?Kam TI, et al. La poli(ADP-ribosa) impulsa la neurodegeneración patológica de alfa-sinucleína en la enfermedad de Parkinson [J]. ), 2018, 362(6414).

[2]?Brundin P, et al. La enzima del cáncer afecta la enfermedad de Parkinson [J Science (Nueva York, NY), 2018, 362(6414): 521-522.