Cómo detectar anticuerpos (ácido nucleico, antígeno, detección de anticuerpos)
Desde el estallido de la epidemia de COVID-19 en 2020, las "pruebas de ácido nucleico", como indicador importante para detectar la infección, han comenzado a aparecer repetidamente en nuestras vidas. El 10 de marzo de 2022, el Equipo Integral del Mecanismo Conjunto de Prevención y Control del Consejo de Estado en respuesta a la epidemia de neumonía por el nuevo coronavirus emitió un aviso, decidiendo promover el modelo de prueba de "detección de antígenos, diagnóstico de ácido nucleico" y adición de antígenos. pruebas como complemento a las pruebas de ácido nucleico.
¿Qué es el Test de Antígenos? ¿En qué se diferencia de otros métodos de detección? En este artículo, tomamos el nuevo coronavirus como ejemplo para hablar sobre métodos comunes de detección rápida, principios relacionados y ámbito de aplicación. Cuando hacemos un cribado, ¿qué podemos comprobar exactamente?
Si queremos detectar una enfermedad o una sustancia, lo primero que tenemos que averiguar es "por dónde empezar". Lo segundo es "cómo". detectar", para que los cambios en el mundo microscópico puedan reflejarse ante nuestros ojos y ayudarnos a emitir juicios. Por dónde empezar
Estamos ante un virus. Según el conocimiento familiar de las clases de biología de la escuela secundaria, los virus son un tipo de organismo realista compuesto de material genético y una cubierta proteica. Si desea detectar una infección de virus, debe comenzar con sus componentes. Espero que leas el siguiente contenido con tus conocimientos de biología de la escuela secundaria.
Tomemos como ejemplo el SARS-CoV-2, que actualmente nos azota. Pertenece al género betacoronavirus de la subfamilia Coronaviridae y es el séptimo coronavirus conocido capaz de infectar a los humanos. Todos los coronavirus son virus de ARN monocatenario de sentido positivo, envueltos, es decir, su material genético es una única hebra de ARN, y esta hebra de ARN puede participar directamente en la traducción como ARNm (ARN mensajero) para guiar la síntesis de proteínas.
La especie de virus numerada NPRC 2020.00002, la imagen fue proporcionada por la Biblioteca Nacional de Recursos de Microorganismos Patógenos (Instituto de Prevención y Control de Enfermedades Virales, Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades).
Nuestro objetivo actual es detectar la presencia de este virus en la muestra, ya sea detectándose a sí mismo o a los productos que trae el virus. Hay dos direcciones por las que podemos empezar: envoltura proteica (envoltura). , material genético. Cómo detectar
Siguiendo esta lógica, la forma más obvia es comprobar si "se puede ver", pero el virus en sí es muy pequeño y el diámetro del SARS-CoV-2 es de 80-120 nm No es realista pensar que cada espécimen pase por un microscopio electrónico y que ni la mano de obra, ni los recursos materiales ni los recursos financieros puedan soportarlo. Un método más rentable es utilizar ciertas medidas para permitir que los "componentes del virus" o "ciertas sustancias especiales que aparecen debido al virus" se acumulen hasta un cierto orden de magnitud y luego brillen, cambien de color y aparezcan. "macroscópicamente".
Entonces nuestro problema es elegir un método que pueda observar cambios a macroescala y correlacionarlos con los componentes del virus y ciertas sustancias causadas por el virus. Los materiales entre los que podemos elegir también están sobre la mesa: el material genético del virus, en este caso su ARN; la envoltura proteica y, si recordamos algunos conocimientos biológicos básicos, el sistema inmunológico del cuerpo también es un buen; candidato a producir anticuerpos después de haber sido infectado con un virus para combatir la invasión.
Varios métodos de detección que utilizamos actualmente se derivan de estas sustancias (y sus sustancias relacionadas), incluida la detección de ácido nucleico para material genético, la detección de antígenos para sobres y la detección de anticuerpos en suero. Prueba de ácido nucleico
Como material genético del virus, la secuencia de ácido nucleico contiene las características genéticas que pueden identificar el virus como una especie específica. Por lo tanto, una prueba de ácido nucleico positiva significa que el virus ha existido en. el cuerpo.
Las "pruebas de ácido nucleico" que estamos realizando actualmente se dividen en dos partes. El muestreo habitual de "meter la nariz" y la "garganta" y la posterior caracterización que hacemos es la primera parte. Después de obtener la muestra, debido a que la cantidad de virus es demasiado pequeña, la muestra se amplificará una cierta cantidad de veces en el laboratorio y la positividad o negatividad se determinará en función de los resultados de la reacción de fluorescencia.
En la segunda parte, las muestras determinadas como positivas deben secuenciarse genéticamente para determinar el tipo de virus en la muestra para su trazabilidad.
Este paso ya no pertenece al ámbito de la detección diaria, pero es de gran importancia en las investigaciones epidemiológicas. Si está interesado en saber más, puede consultar Wikipedia para obtener una breve introducción.
Las pruebas de ácido nucleico en las que habitualmente participamos como herramienta de cribado se refieren a la primera parte cualitativa recogida.
Después de la infección por SARS-CoV-2, el ácido nucleico viral se puede encontrar en hisopos de garganta, esputo, secreciones del tracto respiratorio inferior, sangre y otras muestras. Existen ciertas diferencias en la tasa positiva de detección de ácido nucleico en diferentes partes de las muestras. A medida que avanza la enfermedad, la tasa de detección de cada parte también cambiará.
Lo que estamos acostumbrados a llamar "hisopo nasal" y "hisopo de garganta" en realidad recogen secreciones y tejidos de la pared posterior de la cavidad faríngea. El primero recoge la nasofaringe y el segundo, la orofaringe. También se utilizan otros estándares, como la saliva, que también se puede utilizar como muestra de prueba. Básicamente, las regulaciones son diferentes en diferentes regiones.
Los hisopos nasales (faríngeos) y los hisopos faríngeos (orales) ya se combinan. la tasa positiva y consideraciones de conveniencia. Las heces y la orina también se pueden utilizar como objetos de recolección de muestras. Y según un estudio de 31 pacientes, la precisión de los hisopos anales es mayor que la del muestreo nasofaríngeo y orofaríngeo. Especialmente en las últimas etapas de la enfermedad, la tasa positiva de hisopos nasales en casos confirmados con hisopos anales es inferior al 30%. . 4 Sin embargo, obviamente, debido a limitaciones operativas, no puede utilizarse como método de primera elección para el cribado temprano.
El siguiente paso es extraer el ácido nucleico del pequeño ejemplar obtenido. Dado que la magnitud del virus en la muestra es demasiado pequeña para analizarla, es necesario amplificarla y etiquetarla. Lo que se debe utilizar también es el conocimiento aprendido en la escuela secundaria: reacción en cadena de la polimerasa (PCR): este paso parece problemático, pero debido a que sus principios y procedimientos se han estudiado bien, en la operación real, solo necesita agregar reactivos y enviarlos. a la máquina La parte más problemática de todo el proceso de prueba de ácido nucleico es lograr que los sujetos de prueba obtengan la muestra de manera segura (risas).
Las agencias locales de control de enfermedades o centros de pruebas comprarán kits de extracción de ácido nucleico y kits de detección de ácido nucleico adecuados. El kit de extracción es responsable de extraer el ARN de muestras mixtas (restos celulares, secreciones, polvo y otras impurezas). Los diferentes métodos de extracción pueden afectar la precisión de la detección posterior. levemente afectado. Posteriormente, el ARN purificado se entregará al kit de detección (algunos kits combinan ambos) para procesos posteriores.
El proceso del kit de prueba que lleva la muestra en la máquina es la reacción más importante de esta prueba: RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real).
A continuación, debes adquirir conocimientos de biología en la escuela secundaria. Una reacción de PCR general tiene los siguientes pasos: Calentamiento: Deje que el ADN bicatenario se desenrolle y se deforme en dos hebras simples. Recocido: Deje que el ADN monocatenario mezclado se combine con cebadores diseñados de acuerdo con los fragmentos que deben copiarse; Ajuste la temperatura, permitiendo que la ADN polimerasa comience a trabajar a lo largo del cebador, copiando la nueva cadena y formando una nueva doble cadena.
Para detectar virus, todo lo que tenemos que hacer son los pasos anteriores, excepto que necesitamos dos cosas más: Antes de la primera reacción, usar la transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN), sintetizar la cadena complementaria. de ARN viral monocatenario y combinarlo en ADNc en las etapas de hibridación y extensión, además de los cebadores y las enzimas necesarias, también se requieren sondas TaqMan;
La sonda TaqMan se puede entender así: su parte principal es una cadena de oligonucleótidos, que está diseñada para emparejarse con una pequeña parte del fragmento del gen que necesita copiarse para formar una forma bicatenaria; un extremo está conectado a una molécula fluorescente y el otro extremo está conectado a un interruptor (grupo de extinción). Cuando los dos están conectados a la sonda, el grupo de extinción suprimirá la fluorescencia y no podrá detectarse. Durante el recocido, esta sonda se une con el cebador al fragmento monocatenario que se va a replicar. Durante el proceso de extensión, la ADN polimerasa cortará los obstáculos que tiene delante, incluida esta sonda. De esta manera se separa el grupo de extinción y la molécula fluorescente y se muestra la fluorescencia.
A medida que aumenta el número de ciclos, cada vez se amplifican más fragmentos de ADN y fluorescencia.
Al comparar el brillo de la fluorescencia de cada ciclo con el brillo de referencia de varios ciclos anteriores, podemos determinar la cantidad actual de fragmentos de ADN, o podemos usar directamente el número de ciclo y el brillo de la fluorescencia para hacer juicios cualitativos.
Entonces, ¿qué parte se debe copiar específicamente? Como queremos detectar virus, seleccionamos los fragmentos de ácido nucleico más representativos. En los estándares actuales, los genes ORF y los genes N son sitios de detección comúnmente utilizados.
El kit de detección se encarga de introducir el ARN extraído (muestra), configurar la temperatura y duración de la PCR correspondiente según las instrucciones del programa del kit y completar el proceso de amplificación bajo el control de la máquina. Se recoge en un enlace fijo y se registra el número de ciclo correspondiente (valor Ct). El criterio para juzgar si el virus es negativo o positivo o si todavía es contagioso es observar el número de ciclo actual cuando la señal de fluorescencia alcanza el umbral. Según el actual "Plan de diagnóstico y tratamiento para la neumonía por nuevo coronavirus (ensayo novena edición)", el estándar para levantar el manejo del aislamiento es un valor Ct ≥ 35. En comparación con el estándar adoptado anteriormente de ≥40, el tiempo entre el alta y la liberación del aislamiento se reducirá considerablemente. Inmunoensayo
La detección de ácidos nucleicos mediante RT-PCR es ahora el estándar de oro para el diagnóstico porque es (teóricamente) 100% exacto desde un punto de vista metodológico. Sin embargo, las pruebas de ácido nucleico llevan mucho tiempo y tienen altos requisitos para el medio ambiente y los operadores. Cuando las condiciones ambientales no cumplen con los estándares y los materiales e instrumentos están incompletos, las pruebas de ácido nucleico a gran escala causarán un enorme consumo de mano de obra y recursos financieros.
En esta epidemia, los inmunoensayos que utilizamos incluyen la detección rápida de antígenos y la detección de anticuerpos. Se basa en la reacción antígeno-anticuerpo como principio básico y tiene como objetivo lograr una rápida neutralización de antígenos y anticuerpos. del analito en la muestra con menor costo de tiempo. Ambos pertenecen a la categoría de inmunocromatografía.
Los test de antígenos que vienen en cajas y que puedes manejar tú mismo son muy adecuados como complemento en situaciones como insuficiencia de suministros y autodiagnóstico. Prueba de antígenos
La prueba de ácido nucleico examina el material genético (firma) del virus, que es el "interior" del virus. Luego, la prueba (rápida) de antígenos comprueba el "exterior" del virus, comprobando directamente las partículas virales completas. Actualmente, existen tres tipos de kits de detección de antígenos aprobados: método de oro coloidal, método de látex y método de inmunocromatografía de fluorescencia. Los principios internos de los tres son consistentes. Sin embargo, el kit de inmunocromatografía de fluorescencia todavía requiere un detector especial o una linterna ultravioleta, que no es adecuada para la autoprueba casera. Tanto el método del oro coloidal como el método del látex convierten los resultados de la prueba en bandas visibles, y la diferencia radica en el etiquetado. Las sustancias son diferentes.
Por supuesto, las pruebas de antígenos tienen naturalmente sus desventajas: su tasa de falsos negativos (positivos pero negativos) es mayor, lo que puede provocar detecciones omitidas y detecciones incorrectas. Pero dada la ventaja de tiempo que supone obtener resultados en una taza de té, la brecha en la precisión puede verse comprometida temporalmente en determinadas circunstancias.
Fuente de la imagen: Cómo funcionan las pruebas de antígeno EUA del SARS-CoV-2 | ASM.org
En comparación con las pruebas de ácido nucleico, las pruebas de antígeno agregan el método de muestreo de "hisopos nasales". reduciendo la dificultad de la autoevaluación personal. La muestra del hisopo se eluye en el tampón. Después de dejar caer el líquido en el orificio de muestreo, el líquido transportará antígenos potenciales a través de la acción capilar y pasará a través de un área (almohadilla de conjugado) precargada con anticuerpos.
Los anticuerpos de esta zona son anticuerpos monoclonales contra el antígeno diana (SARS-CoV-2). Cada molécula de anticuerpo se combina con una etiqueta especial y reacciona con el antígeno de la muestra. Se forman complejos que fluyen a la siguiente banda debido a la acción capilar.
Lo que pasa a continuación es la línea de prueba (línea T, línea de prueba). Adjuntos a la línea de prueba hay anticuerpos monoclonales contra el antígeno objetivo. Puede comprender que las cosas aquí son las mismas que las de la unión. almohadilla, solo que sin la marca. En este punto, si el sujeto ha sido infectado con SARS-CoV-2, el complejo antígeno-anticuerpo formado por el antígeno que dejó en la muestra se recombinará con los anticuerpos fijados aquí en el hilo. Aquí, estos complejos marcados se depositan y eventualmente aparecen como una banda oscura o poco profunda.
La fuente de color de la tira es la etiqueta adherida a la molécula de anticuerpo en la almohadilla de unión anterior. En el método de oro coloidal, son las partículas de oro coloidal. En el método de látex, son las gotas de látex coloreadas. es la molécula fluorescente. Entonces, cuando use este tipo de papel de prueba, encontrará que justo después de agregar la muestra y el líquido comienza a esparcirse, habrá un poco de color claro en el frente de la difusión que continúa moviéndose. Este es el color del papel de prueba. marca que aún no ha sido depositada en forma fija.
A continuación, el líquido continúa esparciéndose y pasa a través de la línea de control de calidad (línea C, línea de control). Unido a la línea de control de calidad hay otro anticuerpo: un anticuerpo monoclonal contra el antígeno diana "anticuerpo monoclonal". ", denominado "anticuerpo secundario". Este nuevo anticuerpo se obtiene haciendo reaccionar el anticuerpo anterior en el sistema inmunológico de otro animal. Por ejemplo, el anticuerpo en la almohadilla de unión proviene de conejo, por lo que el anticuerpo aquí proviene de oveja y es un anticuerpo monoclonal anti-conejo de oveja. En otras palabras, el antígeno del anticuerpo secundario es el anticuerpo que se encontraba previamente en la plataforma de unión. Esta línea existe para detectar si el líquido se difunde normalmente, si los anticuerpos en la almohadilla de unión han fallado, etc. En este momento, una gran cantidad de anticuerpos de la almohadilla de unión que quedan en el líquido servirán como antígenos y reaccionarán con los anticuerpos secundarios en la línea de control de calidad para formar un complejo y mostrar una banda obvia.
Dado que el anticuerpo en la almohadilla de unión es muy abundante, esta línea de control de calidad aparecerá muy rápidamente y será muy colorida. Sin embargo, dado que el número de antígenos (virus) en la línea de detección no es constante, el número de antígenos (virus) en la línea de detección no es constante. La velocidad de desarrollo del color será diferente, pero generalmente 15 minutos son suficientes para juzgar el resultado. Así que no mires la línea C obvia. Si la línea T es vaga, sentirás que "está bien", independientemente de la profundidad de la línea T, siempre que esté presente, es positiva.
Para operaciones específicas, puede consultar los videos instructivos publicados por la Administración Médica y la Autoridad Hospitalaria. En la actualidad, el país también está promoviendo gradualmente kits de autoprueba de antígenos, que hasta cierto punto pueden reducir la presión sobre la atención médica y de calle en el futuro. Detección de anticuerpos en suero
Además de los dos primeros métodos de detección, existe otro método de detección que no se utiliza mucho pero que es igualmente importante, que es la "detección de anticuerpos en suero" que también es un método de inmunoensayo.
El kit utilizado para la detección de anticuerpos es muy similar al de detección de antígenos, pero la muestra es más limitada: dado que el objeto de prueba se convierte en un anticuerpo, la muestra debe ser sangre (o plasma, etc.) con presencia clara de anticuerpos en suero). Además, el cuerpo humano no produce anticuerpos inmediatamente después de la primera infección con el virus. Los anticuerpos son claramente detectables en niveles una o dos semanas después de la infección inicial (o vacunación). Estas condiciones limitan la capacidad de las pruebas de anticuerpos para usarse como prueba de diagnóstico. Actualmente, las pruebas de anticuerpos séricos sólo se utilizan para comprobar si la vacuna es eficaz en determinadas circunstancias o para comprobar si el sujeto de prueba ha sido infectado recientemente con el nuevo coronavirus.
Existen cinco tipos de anticuerpos en el cuerpo humano, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. La IgA es la principal responsable de la inmunidad de las mucosas. La IgD se asocia con la activación de las respuestas inmunitarias. La IgE protege contra los parásitos y también participa en reacciones alérgicas. Las IgG e IgM restantes son las principales fuerzas enviadas por el sistema inmunológico en la lucha contra los patógenos.
Como patógeno, el SARS-CoV-2 secreta principalmente IgG e IgM tras la estimulación. Los kits de detección de anticuerpos existentes se dirigen principalmente a las IgG e IgM producidas por el cuerpo humano en respuesta a la proteína N (proteína de la nucleocápside) o la proteína S (proteína de pico) del SARS-CoV-2.
El aspecto del dispositivo de detección del kit de anticuerpos es el mismo que el del detector de antígenos. La diferencia entre los dos son las sustancias adheridas a la almohadilla de unión, la línea de detección y la línea de control de calidad mencionadas anteriormente.
Esta vez, la muestra caída en el pozo puede tener anticuerpos contra el SARS-CoV-2. Por lo tanto, en la plataforma de unión debe haber antígenos marcados; por supuesto, es imposible liberar virus vivos. Generalmente, las proteínas antigénicas utilizadas aquí están diseñadas para ser detectadas, como la proteína N o la proteína S mencionadas anteriormente, o los virus recombinantes, sin importar de qué tipo sean, deben contener un dominio de unión al receptor (RBD) como objetivo del anticuerpo. vinculante. . En la línea de prueba, se adjunta un anticuerpo anti-IgM o anti-IgG para capturar la proteína del anticuerpo unida al antígeno. Finalmente, se unen anticuerpos específicos de antígeno a la línea de control de calidad para capturar el antígeno libre restante.
Resumen
En general, los tres métodos de detección abordan necesidades diferentes, tienen ventajas y se complementan entre sí. La prueba de ácido nucleico es el estándar de oro. Comprueba directamente el ARN del virus y es responsable de ver si la persona a la que se le realiza la prueba tiene el virus. La prueba de antígeno es un método de detección rápida que comprueba la proteína del virus, pero no es tan bueno. precisa como la prueba de ácido nucleico. No es adecuada para personas infectadas que son altamente contagiosas. Más eficaz, la prueba de anticuerpos comprueba si la vacuna es eficaz y si la persona ha sido infectada con el virus recientemente.
Recientemente, la epidemia del nuevo coronavirus ha regresado a varios lugares. En comparación con la variante Delta, anteriormente popular, la variante Omicron tiene una tasa de letalidad y una tasa de enfermedad grave significativamente más bajas, pero su período de incubación es más corto, el virus se replica más rápido y su infectividad aumenta significativamente. Espero que todos se mantengan saludables en este ambiente.